1、宁夏医科大学学报45卷收稿日期：2022-11-07基金项目：国家自然科学基金项目（82160465）；宁夏自然科学基金项目（2021AAC03123）作者简介：杨晓莹（1996），在读硕士研究生，研究方向：肿瘤的分子诊断与治疗。通信作者：楚元奎（1980），男，博士，教授，研究方向：肿瘤致病机制和分子靶向治疗。E-mail：前列腺癌（prostate cancer，PCa）是男性最常见的恶性肿瘤之一。2020 年，全球有近 140 万PCa 新发病例，37.5 万人因 PCa 死亡1。在中国男性癌症患者中，PCa 的发病率排名第 6（8.16%），病死率排名第七（13.61%）2。目前，前列
2、腺特异性抗原（prostate specific antigen，PSA）筛查3结合影像学检查有效地增强了 PCa 的临床诊断效果4。但雄激素受体的变异和 PCa 的耐药及转移等使其诊断、预后和治疗变得更难。因此进一步揭示PCa 的分子发病机制，寻找新的更加有效地诊断和治疗靶点对于 PCa 的临床诊治具有积极意义5。MicroRNAs（miRNAs）是一类非编码 RNA，可通过识别靶基因 3-非翻译区的互补序列导致mRNA 降解或抑制蛋白的翻译，包括 PCa 在内的一些恶性肿瘤的起始和进展与 miRNAs 的异常表达密切相关6。miR-30 和 miR-214-5p 可抑制前列腺癌细胞的增殖、
3、转移和上皮间充质转化7-8。已知 miR-3064-5p 在肝癌、胃癌、宫颈癌等多种癌症中表达下调，并发挥抑癌作用9-11。作为抑癌分子的 miR-3064-5p 在多种癌症中表达下调，其机制尚未见报道。有研究12表明，包括 DNA 甲基化、组蛋白修饰等在内的表观遗传学修饰调控着癌症进展中抑癌分子的表达。DNA 甲基化修饰可通过增强 miRNAs 启动子内 CpG 区域的甲基化，导致 miRNAs 的表达下调13-14。一些抑癌miRNAs，如 miR-27a、miR-141 和 miR-200C 已被证明在 PCa 中呈高甲基化状态15-16。课题组前期研究17证实，miR-3064-5p
4、在PCa细胞中的表达降低。生物信息学分析发现，miR-3064-5p 启动子区存在 CpG 岛，提示其可能受到了 DNA 甲基化调控的影响。本研究通过使用去甲基化药物地西他滨（decitabine，DAC）处理 PCa细胞，甲基化特异性PCR（methylation-specific PCR，MSP）和 qRT-PCR 检测 miR-3064-5p 启动子的甲基化状态和表达水平，明确 PCa 细胞中 miR-3064-5p的沉默是否与甲基化调控有关，以期为后续miR-地西他滨通过甲基化调控 DU145 细胞中 miR-3064-5p 的表达杨晓莹1，胡东来1，李元1，杨华1，楚元奎1，2（1.
5、宁夏医科大学临床医学院，银川750004；2.宁夏医科大学总医院医学实验中心，银川750004）摘要：目的探讨 miR-3064-5p 在前列腺癌（PCa）细胞中的表达调控机制。方法利用脂质体转染法将阴性对照（NC）组及 miR-3064-5p 模拟物（miR-3064-5p mimics）转染入 PCa 细胞 DU145 中，细胞平板克隆实验、划痕实验、Western blot 法分别检测 DU145 细胞增殖和迁移侵袭能力；qRT-PCR 检测前列腺正常上皮细胞及PCa 细胞中 miR-3064-5p 的表达；生物信息学软件分析，甲基化特异性 PCR（methylation-specifi
6、c PCR，MSP）检测 miR-3064-5p 启动子区的甲基化水平；使用地西他滨（decitabine，DAC）处理 DU145 细胞，MSP 和 qRT-PCR 分别检测 DAC 对 miR-3064-5p 启动子甲基化状态和表达的影响；Western blot 检测相关蛋白水平。结果过表达 miR-3064-5p 可抑制 DU145 细胞的增殖和转移（P 均0.05）；与正常前列腺上皮细胞 RWPE-1 相比，miR-3064-5p 在前列腺癌细胞中表达均下调（P 均0.05）；miR-3064-5p 的启动子区存在甲基化岛，miR-3064-5p 启动子区的甲基化水平高于正常前列腺细
7、胞（P0.05）；DAC 处理后，DU145 细胞中 miR-3064-5p 启动子区的甲基化水平降低，甲基化转移酶（DNMT3B）的表达降低，同时，miR-3064-5p 的表达增强，并促进了 E-Cadherin 的表达，抑制了 Vimentin 及 PCNA 的表达（P 均100 个细胞的克隆数。1.2.8划痕实验取对数生长期的 DU145 细胞接种于 6 孔板中，每孔 2105个细胞，转染 24 h后使用枪头对各孔平行画线，PBS 洗后加入新鲜培养液继续培养 24 h 后，对各孔细胞于指定位置进行拍照，Image J 测量细胞迁移面积并进行统计学分析。1.2.9Western blot
8、 检测收集 DAC 处理和转染的 DU145 细胞，Western blot 法检测 E-Cadherin、Vimentin、PCNA、DNMT3B、GAPDH 的表达。操作如下：使用试剂盒提取细胞总蛋白，蛋白定量检测（BCA）法测定蛋白含量，每组各取 40 g 蛋白进行 SDS-PAGE 电泳，湿转至 PVDF 膜，5%脱脂奶粉溶液封闭，加入一抗 4 孵育过夜，TBS-T 漂洗，二抗室温孵育 2 h，TBS-T 漂洗，ECL 化学发光试剂显影，照相，Image J 软件测量各条带灰度值。1.3统计学方法使用 Graphad Prism 8.0 和 SPSS 19.0 分析软件对相关数据进行统
9、计学分析。计量资料以均数标准差（xs）表示。两组间比较采用 t 检验，多组间比较采用方差分析。P0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1过表达 miR-3064-5p 降低 DU145 细胞的增殖和迁移能力qRT-PCR 检测 miR-3064-5p mimics 的转染效果。结果显示，与 NC 组相比，转染 miR-3064-5p mimics 48 h 后，DU145 细胞中 miR-3064-5p的表达水平增强（图 1A）。划痕愈合实验、克隆形成实验和 Western blot 实验。结果显示，与 NC 组相比，miR-3064-5p 转染组 DU145 细胞的迁移能力和克隆形成能力降
10、低（图 1B、图 1C）；miR-3064-5p 转染组 PCNA 和 Vimentin 的表达均降低，E-Cadherin 的表达升高（图 1D）。A.qRT-PCR 检测 miR-3064-5p 转染效率；B.划痕实验；C.平板克隆实验；D.Western blot 实验；与 NC 组比较*P0.01。图 1过表达 miR-3064-5p 对 DU145 细胞增殖迁移能力的影响2.2miR-3064-5p 在正常前列腺上皮和前列腺癌细胞中的表达qRT-PCR 检测各细胞中 miR-3064-5p 的表达结果显示，与正常前列腺上皮细胞 RWPE-1细胞相比，前列腺癌细胞株中 miR-3064
11、-5p 的表达均下调（P 均0.01），见图 2。ABCDDU145DU145DU145DU145*NC miR-3064-5p mimicsNC miR-3064-5p mimicsNC miR-3064-5p mimicsNC miR-3064-5p mimicsNCmiR-3064-5p mimicsNCmiR-3064-5p mimicsE-CadherinVimentinPCNAGAPDHE-CadherinVimentinPCNA40030020010002.01.51.00.50.086420504030201000 h24 hmiR-3064-5p 相对表达水平划痕愈合率（%t
12、o NC）细胞克隆数各蛋白相对表达水平（/CAPDH）*3584期2.3miR-3064-5p 启动子甲基化分析使用 UCSC 网站预测结果显示，miR-3064-5p 启动子区存在 1 个 CpG 岛（图 3A）。MSP 检测结果显示，与正常前列腺上皮细胞相比，22RV1、DU145 和 PC3 细胞中 miR-3064-5p 启动子甲基化水平增强（图 3B）。2.4DAC 对 DU145 细胞中 miR-3064-5p 启动子甲基化水平的影响MSP 结果显示，DAC 处理后，DU145 细胞中miR-3064-5p 启动子甲基化特异性产物减少（图4A），Western blot 检测 DN
13、MT3B 的表达结果显示，DAC 处理后，DNMT3B 的表达降低（图 4B）。2.5DAC 恢复了 DU145 细胞中 miR-3064-5p的表达和作用qRT-PCR 检测结果显示，与 0 mol L-1组相比，5 mol L-1和 10 mol L-1DAC 处理的DU145 细胞中 miR-3064-5p 的表达均升高（P均0.05），并且在本研究剂量范围内，随着 DAC浓度升高，miR-3064-5p 的表达也随之增强（图5A）。Western blot 结果显示，DAC 处理后，PCNA和 Vimentin 的表达均降低，E-Cadherin 的表达增强（P 均0.05），并且随着
14、 DAC 处理浓度升高，PCNA 和 Vimentin 的表达逐渐降低，E-Cadherin的表达则逐渐增强（图 5B）。3讨论PCa 在男性全球癌症发病率中排名第 2，是男性癌症相关死亡的主要原因1。目前对 PCa 的治疗方法，包括前列腺切除术、放疗和雄激素剥夺治疗（ADT）等，提高了存活率，但晚期 PCa 治与 RWPE-1 细胞比较*P0.01。图 2miR-3064-5p 在正常前列腺上皮和前列腺癌细胞中的表达A.MSP 检测 DAC 对 miR-3064-5p 启动子甲基化的影响，M：甲基化特异性产物，U：甲基化非特异性产物；B.Western blot检测甲基化转移酶的表达；与 0
15、 mol -1DAC 组比较*P0.01。图 4DAC 对 DU145 细胞中 miR-3064-5p 启动子甲基化水平的影响A.生信软件分析 miR-3064-5p 启动子 CpG 岛；B.MSP 检测在正常前列腺上皮细胞及前列腺癌细胞中 miR-3064-5p 启动子甲基化水平；M：甲基化特异性 PCR 产物；U：甲基化非特异性 PCR 产物。图 3miR-3064-5p 启动子甲基化分析ABUM11.721.261.2010.680.790.97RWPE-1 22RV1DU145PC31.51.00.50.0miR-3064-5p 相对表达水平*RWPE-122RV1DU145PC3*D
16、U145ABDU145UMDNMT3BGAPDH110.920.761.021.130 mol L-1DAC5 mol L-1DAC10 mol L-1DAC0 mol L-1DAC5 mol L-1DAC10 mol L-1DAC0 mol L-1DAC5 mol L-1DAC10 mol L-1DAC1.51.00.50.0DNMT3B 相对表达水平（/CAPDH）杨晓莹，等.地西他滨通过甲基化调控DU145细胞中miR-3064-5p 的表达359宁夏医科大学学报45卷A.qRT-PCR 检测结果；B.Western blot 检测相关蛋白表达；*P0.05，*P0.01。图 5DAC 通过 DNA 甲基化对 DU145 细胞中 miR-3064-5p 的影响疗效果仍然较差。因此，开发针对 PCa 的额外疗法具有重要意义。miRNAs 是一种内源性非编码小分子，通过降解 mRNAs 和抑制蛋白质合成来影响细胞的生物过程。研究18发现，miRNAs 影响着癌症发生发展的全过程，并且在多种癌症中被作为潜在的诊断和预后标记物。miR-30 可靶向 PCa 中重要的致癌基因 ERG，过表
