1、基金项目:青海省科技计划项目(2018 ZJ 793)作者简介:苏英，女，1985 06 生，学士，主治医师，E-mail:hutianhong86163 com收稿日期:2022 11 22低氧条件下 M2 型巨噬细胞外泌体对卵巢癌细胞恶性生物学行为的影响及机制苏英1，李富娟1*，王洋2(1青海省第五人民医院妇瘤科，西宁810001;2青海省第五人民医院中医科;*通讯作者，E-mail:546658156 qq com)摘要:目的探究低氧条件下 M2 型巨噬细胞外泌体对卵巢癌细胞生物学功能的影响及机制。方法人单核细胞系THP1 诱导分化为 M2 型巨噬细胞，提取并且鉴定正常培养条件下 M2
2、型巨噬细胞外泌体(N-M2 exo)以及缺氧培养条件下 M2型巨噬细胞外泌体(H-M2 exo)。SKOV-3 细胞分为 PBS 组、N-M2 exo 组和 H-M2 exo 组，分别与 PBS、10 g/ml 的 N-M2 exo 和H-M2 exo 共孵育 48 h，CCK-8 法检测各组细胞增殖能力，Transwell 小室检测各组细胞迁移和侵袭能力，流式细胞术检测各组细胞凋亡水平，Western blot 检测各组细胞 MEK 和 EK 的磷酸化水平。结果相比于 PBS 组，N-M2 exo 组和 H-M2 exo 组SKOV-3 细胞增殖能力、迁移能力、侵袭能力均显著增加(P0 05
3、)，细胞凋亡水平显著下降(P 0 001)，MEK 和 EK 的磷酸化水平显著增加(P0 001)。相比于 N-M2 exo 组，H-M2 exo 组 SKOV-3 细胞增殖能力、迁移能力、侵袭能力均显著增加(P 0 05)，细胞凋亡水平显著下降(P0 001)，MEK 和 EK 的磷酸化水平显著增加(P0 001)。结论低氧条件下 M2 型巨噬细胞外泌体促进卵巢癌细胞生长和转移，其机制可能与激活 MEK/EK 信号通路有关。关键词:低氧;巨噬细胞;卵巢癌;外泌体;MEK/EK 信号通路中图分类号:73731文献标志码:A文章编号:1007 6611(2023)04 0440 06DOI:10
4、13753/j issn1007 66112023 04 005Effect and mechanism of M2 macrophage exosomes on malignant biological behaviors of ovarian cancer cells under hypoxicconditionSU Ying1，LI Fujuan1*，WANG Yang2(1Department of Gynaecology and Oncology，Fifth People s Hospital of Qinghai Province，Xining810001，China;2Depar
5、tment of Traditional Chinese Medicine，Fifth People s Hospital of Qinghai Province;*Corresponding author，E-mail:546658156 qq com)Abstract:ObjectiveTo explore the effect and mechanism of M2 macrophage exosomes on the biological functions of ovarian cancercells under hypoxic conditionMethodsTHP1 was in
6、duced to differentiate into M2 macrophages，and the exosomes secreted by M2macrophages under normal and hypoxic culture conditions were extracted and identified，namely N-M2 exo and H-M2 exo SKOV-3cells were incubated with PBS，10 g/ml N-M2 exo and H-M2 exo for 48 h in PBS group，N-M2 exo group and H-M2
7、 exo group，respectively CCK-8，Transwell and flow cytometry were used to detect the proliferation，the metastasis and the apoptosis，respectivelyThe phosphorylation levels of MEK and EK were detected by Western blotesultsCompared with PBS group，the proliferation，migration and invasion abilities of SKOV
8、-3 cells were significantly increased in N-M2 exo group and H-M2 exo group(P0 05)，theapoptosis was significantly decreased(P0 001)，and the phosphorylation levels of MEK and EK were significantly increased(P 0 001)Compared with N-M2 exo group，the proliferation，migration and invasion abilities of SKOV
9、-3 cells were significantlyincreased in H-M2 exo group(P 0 05)，the apoptosis was significantly decreased(P 0 001)，and the phosphorylation levels ofMEK and EK were significantly increased(P0 001)ConclusionUnder hypoxic condition，M2 macrophage exosomes could pro-mote the growth and the metastasis of o
10、varian cancer cells，which may be related to the activation of MEK/EK signal pathwayKey words:hypoxia;macrophages;ovarian cancer;exosome;MEK/EK signaling pathway卵巢癌是常见的妇科恶性肿瘤1，由于缺乏有效肿瘤筛查和诊断标志物，近 70%的患者在确诊时就已经处于肿瘤的中晚期，即使接受放化疗，患者预后较差，存在严重的肿瘤复发和转移等问题2，因此，非常需要寻求有效的新型治疗靶点。在肿瘤免疫的研究中，巨噬细胞主要分为 M1 和 M2 两种亚型，其
11、中 M2 型巨噬细胞与肿瘤相关巨噬细胞相似，具有促进肿瘤病理进程的作用3。缺氧是肿瘤微环境的常见特征，可诱导肿瘤的生长、转移、血管新生、免疫逃逸等4。外泌体是一类细胞外纳米级囊泡，具有细胞间信息传递的作用5，研究表明 M2 型巨噬细胞来源的外泌体可促进肝癌等肿瘤生长6，044J Shanxi Med Univ，Apr 2023，Vol 54 No 4然而 M2 型巨噬细胞外泌体对卵巢癌的影响以及缺氧条件诱导 M2 型巨噬细胞外泌体对卵巢癌的影响尚无研究。本研究通过观察缺氧条件下 M2 型巨噬细胞外泌体对卵巢癌生长和转移的影响，探讨其作用机制。1材料与方法1 1材料人卵巢癌细胞系 SKOV-3
12、和人单核细胞系THP1 购自中国科学院上海细胞库，佛波酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA)和白介素 4(interleu-kin-4，IL-4)均购自美国 Sigma 公司，FastQuant TKit、ealUniversal Color PreMix、Trizol 试 剂 购 自TIANGEN 公司，CD9、TSG101、CD81、p-MEK、MEK、p-EK、EK、GAPDH、山羊抗兔 IgG 购自武汉三鹰生物技术有限公司，CCK-8 检测试剂盒和细胞凋亡检测试剂盒购自沈阳万类生物技术有限公司，HT7700 透射电镜购自日本 Hitachi 公司。
13、1 2方法1 2 1细胞培养及 M2 型巨噬细胞诱导分化取液氮保存的 SKOV3 细胞和 THP-1 细胞迅速解冻，分别培养于含10%FBS 的 DMEM 和 DMEM/F12 培养基中。THP-1 与25 ng/ml 的 PMA 共孵育48 h，诱导THP-1 分化为 M0 型巨噬细胞，分化后的 M0 型巨噬细胞与50 ng/ml IL-4 和20 ng/ml IL-13 共孵育48 h(M0+IL-4+IL-13 组)，诱导 M2 型巨噬细胞分化7。正常条件下的 M2 型巨噬细胞(N-M2)置于含 5%CO2，37 的细胞培养箱中，缺氧诱导的 M2巨噬细胞(H-M2)置于含90%N2，5%
14、CO2的培养箱中培养。1 2 2外泌体的提取与鉴定分别将 N-M2 和 H-M2 细胞以5 106个的量接种至10 cm 的培养皿中，收集细胞培养上清液，300g 离心 10 min，取上清，2 000g离心 10 min，取上清液，10 000g 离心 30 min，然后将上清液以 140 000g 离心 90 min，所得沉淀即为外泌体(N-M2 exo 和 H-M2 exo)，将外泌体用无菌PBS 400 l 重悬，80 条件下保存。所得外泌体滴加 20 l 至透射电镜所用铜网上，在红外灯下烘烤 10 min，使用磷钨酸染色 10 min，在 HT7700 透射电镜下观察外泌体结构。We
15、stern blot 法检测外泌体标志蛋白 CD9、TSG101、CD81。1 2 3细胞分组SKOV3 细胞分为 PBS 组、N-M2exo 组和 H-M2 exo 组，N-M2 exo 组和 H-M2 exo 组细胞分别与 10 g/ml 的 N-M2 exo 和 H-M2 exo 共孵育48 h，PBS 组与等体积的 PBS 溶液共孵育48 h。1 2 4qT-PC 检测 CD86、TNF-、CD163、IL-10、GAPDH mNA 表达量使用 Trizol 试剂提取 M0 巨噬细胞以及 M2 型巨噬细胞总 NA，然后使用核酸定量仪定量，取 2 l 的总 NA，使用 FastQuant
16、 TKit 将 NA 逆转为 cDNA，所得 cDNA 于80 条件下保存。使用 ealUniversal Color PreMix 试剂盒进行 qT-PC 反应，引物序列见表 1。反应体系为:SYB Green 20 l、Primer forward 0 8 l、Primerreverse 0 8 l、DEPC 水 6 l、Dye 0 4 l、cDNA 模板 2 l，反应条件为:95 预变性30 s，95 预变性15 s，60 退火1 min，72 延伸 1 min，循化 40 次后，72 彻底延伸 10 min。记录 Ct 值，以 GAPDH为内参，计算并比较 2 Ct值。表 1CD86、TNF-、CD163、IL-10 引物序列Table 1Primer sequences of CD86，TNF-，CD163，IL-10基因序列CD86Forward:5 TGGTGCTGCTCCTCTGAAGATTC 3everse:5 ATCATTCCTGTGGGCTTTTTGTG 3TNF-Forward:5 GACAAGCCTGTAGCCCATGTTGTA 3everse:5 CAGCC
