1、蛋白质结构(jigu)测定,2011-3-30,第一页，共七十五页。,蛋白质三维结构(jigu)测定方法及数量,第二页，共七十五页。,蛋白质三维结构测定(cdng)年增长图,第三页，共七十五页。,第一节：X-射线(shxin)衍射技术用于蛋白质晶体结构测定,原理(yunl)基本过程优缺点应用实例,第四页，共七十五页。,一、相关(xinggun)原理,光的衍射(ynsh)现象X射线的发现及应用本质的争论X射线衍射的发现晶体学基础知识X射线晶体衍射,第五页，共七十五页。,?,光线(gungxin)拐弯了！,1.光的衍射(ynsh)现象,第六页，共七十五页。,衍射(ynsh)现象：光波偏离直线传播而
2、出现光强不均匀 分布的现象,当缝的大小（或障碍物的大小）跟波长(bchng)相差不多时就发生明显的衍射现象如果缝很宽，其宽度远大于波长(bchng)，则波通过缝后基本上是沿直线传播的，衍射现象就很不明显了,第七页，共七十五页。,惠更斯菲涅耳原理(yunl),菲涅耳补充：从同一(tngy)波阵面上各点发出的子波是相干波。1818年,惠更斯：光波阵面上每一点都可以看作新的子波源，以后任意(rny)时刻，这些子波的包迹就是该时刻的波阵面。1690年,解释不了光强分布！,第八页，共七十五页。,2.X射线的发现历程(lchng)及应用,失之交臂1836 法拉第 发现阴极射线1861 克鲁克斯 阴极射线管
3、在放电时会产生亮光 干版和光片有问题？1890 古德斯柏德 洗出了一张X射线的透视底片(dpin)照片的冲洗药水或冲洗技术 发现X射线本质的争论X射线衍射,第九页，共七十五页。,2.X射线的发现(fxin)及应用,1895年 伦琴（Roentgen）发现故称为(chn wi)伦琴射线。,第十页，共七十五页。,伦琴夫人(f rn)的手的X射线照片,第十一页，共七十五页。,X射线在医学(yxu)上的应用,伦琴的新发现轰动了全世界,不到三个月,维也纳的一家医院便拍出了应用于医疗的X射线照片.从此,X射线拍片和射线透视成为医学诊疗(zhnlio)中常用的手段。为了防止各脏器成像发生的重叠给诊疗带来不便
4、,科学家们进一步研究了成像更清晰、灵敏度更高的仪器。1972年，英国科学家汉斯菲尔德运用计算机和图像重建理论,制成了电子计算机射线断层扫描成像装置,也就是已被广泛应用的CT。,第十二页，共七十五页。,X射线与诺贝尔奖物理学奖,伦琴因发现X射线而获得第一届诺贝尔物理学奖。1903 年诺贝尔物理学奖。1906 年的诺贝尔物理学奖。劳厄获得了1914 年诺贝尔物理学奖。英国的布拉格父子1915 年的诺贝尔物理学奖。英国的巴克拉1917 年的诺贝尔物理学奖。瑞典物理学家(w l xu ji)西格班1924 年诺贝尔物理学奖。美国的康普顿1927 年诺贝尔物理学奖。前苏联的切连科夫1958 年诺贝尔物理
5、学奖;美国的霍夫斯塔特1961 年诺贝尔物理学奖;瑞典的西格巴恩1981 年的诺贝尔物理学奖。,第十三页，共七十五页。,第十四页，共七十五页。,化学奖,荷兰的物理化学家德拜1936 年诺贝尔化学奖。美国(mi u)著名化学家鲍林1954 年诺贝尔化学奖。英国生物学家肯德鲁与佩鲁茨1962 年诺贝尔化学奖。英国女化学家霍奇金1964 年诺贝尔化学奖。美国化学家利普斯科姆1976 年诺贝尔化学奖。英国化学家桑格和美国化学家吉尔伯特1980 年诺贝尔化学奖。英国生物化学家克卢格因1982 年诺贝尔化学奖;美国化学家豪普特曼和卡尔1985 年诺贝尔化学奖;1988 年,米歇尔等三位德国生物化学家诺贝尔
6、化学奖。,第十五页，共七十五页。,3.X射线本质(bnzh)的争论,第十六页，共七十五页。,X射线本质的争论(zhngln)-波动说,巴克拉：X射线波动性 标识谱线：不管元素(yun s)已化合成什么化合物，它们总是发射一种硬度的X射线，当原子量增大时，标识X射线的穿透本领会随着增大。这说明X射线具有标识特定元素(yun s)的特性。,第十七页，共七十五页。,X射线本质(bnzh)的争论微粒说,X射线微粒论者 粒子具有(jyu)旋转性,布拉克父子(f z),第十八页，共七十五页。,4.X射线衍射(ynsh),第十九页，共七十五页。,X射线衍射(ynsh)的获得,波长范围：100.1埃欲观察其衍
7、射现象则衍射线度应与其波长差不多，晶体的晶格常数恰是这样的线度衍射波的两个基本特征衍射线（束）在空间分布的方位（衍射方向）和强度(qingd)与晶体内原子分布规律（晶体结构）密切相关。,第二十页，共七十五页。,第二十一页，共七十五页。,X射线晶体结构分析？使用X射线作为物理工具，依赖X射线衍射现象为物理原理(yunl)，以晶体作为研究对象，晶体结构作为研究结果的一种分析方法。,第二十二页，共七十五页。,5.X射线的获得(hud)：,X射线管,激光(jgung)等离子体,同步(tngb)辐射,X射线激光,第二十三页，共七十五页。,6.晶体(jngt)基础,什么是晶体(jngt)晶体的周期排布晶体
8、的对称性,第二十四页，共七十五页。,3.1什么(shn me)是晶体,固体物质晶体相当罕见的东西？非晶体晶体(Crystal)指离子(lz)、原子或分子这些微粒在三维空间中周期性重复排列形成的、能够给出明锐衍射的固体结构。,第二十五页，共七十五页。,晶体(jngt)什么样（1）,第二十六页，共七十五页。,晶体(jngt)什么样（2）,第二十七页，共七十五页。,晶体(jngt)什么样（3）,第二十八页，共七十五页。,晶体(jngt)什么样（4）,第二十九页，共七十五页。,2.晶体(jngt)和点阵结构,晶体的周期性结构(jigu)使得我们可以把它抽象成“点阵”来研究.一维周期性结构与直线点阵二维
9、周期性结构与平面点阵三维周期性结构与空间点阵,第三十页，共七十五页。,一维周期性结构与直线(zhxin)点阵,第三十一页，共七十五页。,二维周期性结构与平面(pngmin)点阵,第三十二页，共七十五页。,三维周期性结构(jigu)与空间点阵,第三十三页，共七十五页。,晶胞(Unit cell)空间点阵的单位（大小和形状完全相同的平行六面体），是晶体结构的最小单位。同一个空间点阵，划分平行六面体的方式是多种多样的。选择平行六面体的原则：所选平行六面体的对称性应符合(fh)整个空间点阵的对称性。选择棱与棱之间直角关系为最多的平行六面体 所选平行六面体之体积应最小。当对称性规定棱间的交角不能为直角关
10、系时，应选择结点间距小的行列作为平行六面体的棱，且棱间的交角接近于直角的平行六面体。,第三十四页，共七十五页。,单位平行六面体，a、b、c、是表征(bio zhn)它本身形状、大小的一组参数，称为格子参数或点阵参数。,第三十五页，共七十五页。,单位平行六面体与坐标轴的关系：棱交角坐标轴之间交角。a、b、c 轴单位。a、b、c、关系有七种情况，与单位平行六面体七种格子(g zi)相对应。,立方(lfng)格子 a=b=c=90o,第三十六页，共七十五页。,三方格子 a=b=c=90o，60，109o2816,第三十七页，共七十五页。,菱面体格子中为特殊角度(jiod)时，演变成的三种立方体格子,
11、第三十八页，共七十五页。,四方(sfng)格子 a=b c=90o,第三十九页，共七十五页。,六方格子 a=bc=90o=120o,第四十页，共七十五页。,正交格子(g zi)a b c=90o,第四十一页，共七十五页。,单斜格子(g zi)a b c=90o 90o,第四十二页，共七十五页。,三斜格子(g zi)a b c 90o,第四十三页，共七十五页。,按结点(ji din)位置，可有四种不同的类型：,P 原始(yunsh)格子（角顶）,C 底心格子(g zi)（角顶、顶底面）,I 体心格子（角顶、体心）,F 面心格子（角顶、每个面）,第四十四页，共七十五页。,P 原始(yunsh)格子
12、（角顶）,第四十五页，共七十五页。,C 底心格子(g zi)（角顶、顶底面）,第四十六页，共七十五页。,I 体心(t xn)格子（角顶、体心）,第四十七页，共七十五页。,F 面心格子(g zi)（角顶、每个面）,第四十八页，共七十五页。,结构中代表各类等同(dngtng)点的结点在空间的排列方式来说，格子的种类有、且只有十四种。,第四十九页，共七十五页。,衍射(ynsh)方向,第五十页，共七十五页。,第五十一页，共七十五页。,二、X射线晶体结构测定基本(jbn)过程,蛋白质获取（提纯）晶体生长并经冷冻技术处理重原子衍生物制备衍射数据收集衍生数据分析和改进结构(jigu)模型的获取（包括修正）,
13、第五十二页，共七十五页。,（2）晶体生长过程(guchng)及影响因素,晶核（尽量少）微晶（可用作晶种）晶体(jngt)在数小时至数月后出现2个问题：是盐晶吗？能给出有用的衍射吗？（多晶/双晶）,第五十三页，共七十五页。,影响因素物理因素：温度、压力、震动(zhndng)、溶剂清洁度、试剂纯度、重力、外加物理场等生物化学因素：pH、离子强度、沉淀剂/添加剂的类型和浓度等其他：溶液过饱和度、纯度等“经验”“机器人”,（2）晶体生长过程及影响(yngxing)因素,第五十四页，共七十五页。,（3）结晶(jijng)方法,批量(p lin)结晶法 batch crystallization透射法 c
14、rystallization by dialysis液相扩散法 liquid diffusion气相扩散法vapor diffusion氢氘交换质谱技术Enhanced amidehydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry,DXMS生物玻璃bioglass,第五十五页，共七十五页。,（4）晶体(jngt)的初步鉴定,第五十六页，共七十五页。,（5）衍射(ynsh)数据收集,晶体的处理：低温液氮气冷流技术(jsh)数据收集仪：底片、面探测器,第五十七页，共七十五页。,衍射(ynsh)分析仪器的发展,射线种类：连续射线 特征(tzhng)射线 电子衍
15、射 中子衍射,探测技术(jsh)：胶片 闪烁体计数器（点）（IP）CCD探测器（面）,图2-22 石英的衍射仪计数器记录图（部分）*右上角为石英的德拜图，衍射峰上方为（hkl）值，代表K衍射,第五十八页，共七十五页。,底片(dpin)（外森堡相机、徘循相机）,优点：多点同时收集容易保存(bocn)价格便宜缺点存在“化学雾”背景和X射线散射背景费时、费力,第五十九页，共七十五页。,计数管（四圆衍射(ynsh)仪）,将X射线光子强度转换为电信号，信号放大后再转换成数字存入计算机随时调用逐点收集(shuj)数据优缺点与底片相反,第六十页，共七十五页。,面探技术(jsh)-SMART APEX-CCD
16、衍射仪,Smart CCD Overview,SMART APEX-CCD探测器,第六十一页，共七十五页。,金属丝构成的面板，可同时多点收集(shuj)将X射线光子强度转换为电信号集计数管的精确和底片的多点收集效率,面探技术(jsh)-SMART APEX-CCD衍射仪,第六十二页，共七十五页。,图像(t xin)板image plate,面探测器的改进由化学材料构成，整块板子密度(md)一致高分辨率可见光下可测量集底片和面探测器的优点于一身,第六十三页，共七十五页。,（6）数据分析,电子密度修饰电子密度图诠释结构模型精化(jn hu)数据处理软件：Denzo,Scalepack,第六十四页，共七十五页。,第六十五页，共七十五页。,第六十六页，共七十五页。,三、X射线晶体结构测定(cdng)优点,分辨率高不损伤样品(yngpn)无污染相对快捷能得到晶体完整性的大量信息,第六十七页，共七十五页。,晶体构象是静态的，不能测定不稳定(wndng)的过渡态的构象；很多蛋白质很难结晶，或者很难得到用于结构分析的足够大的单晶；（瓶颈）X射线晶体衍射的工作流程较长。,四、X射线晶体结构测定(cdng
