1、第一章基因工程(jyn gngchng),第一节工具(gngj)酶的发现和 基因工程的诞生,第一页，共五十一页。,基因工程(jyn gngchng),背景(bijng)：家蚕能够吐出蚕丝为人类利用。但繁殖慢，产量低。,能否让大肠杆菌(d chn n jn)也能吐蚕丝呢？,大肠杆菌繁殖很快，但不会产丝。,第二页，共五十一页。,用人工方法，把甲生物的某个基因提取出来，在体外进行切割、拼接和重组，然后将其导入乙生物的细胞内进行大量复制，并进行表达，从而定向地改变(gibin)乙生物的遗传性状，或获得人类所需要的基因产物（蛋白质、多肽、酶）。,剪切拼接(pn ji)导入,甲生物(shngw),取出所需
2、基因,生物新类型,表达,新的生物产品,乙生物,基因工程,第三页，共五十一页。,基因的大小以纳米计算，要对它进行剪切、拼接(pn ji)等操作，没有非常精细的工具是不行的。进行基因操作最少需要以下三种工具：,、基因(jyn)的手术刀,、基因(jyn)的针线,3、基因的运输工具,第四页，共五十一页。,主要(zhyo)在原核生物中。,特异性。即一种限制性内切酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切割点上将DNA分子(fnz)切断（使连接脱氧核苷酸的磷酸二酯键断裂）。,已发现(fxin)数千种,种类:,来源:,特点:,、基因的剪刀,限制性核酸内切酶,第五页，共五十一页。,例如(lr)：大肠杆菌的一
3、种限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。,限制(xinzh)酶,第六页，共五十一页。,粘性(zhn xn)末端,粘性(zhn xn)末端,被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们两个之间正好反向互补配对，这样的切口叫粘性(zhn xn)末端。被同一种限制酶切断的几个DNA就具有相同的粘性末端，能够通过互补进行配对。,第七页，共五十一页。,不同的限制(xinzh)酶所形成的粘性末端不同,第八页，共五十一页。,、基因(jyn)的针线,作用(zuyng)：,将粘性末端碱基互补的两个(lin)DNA片段连接起来，使之成为一个完整的DNA分子（使两个DNA片段通过磷酸二
4、酯键连接成一个DNA分子）。,DNA连接酶,第九页，共五十一页。,第十页，共五十一页。,3、基因(jyn)的运输 工具,基因载体(zit)的条件：,能够在宿主细胞(xbo)中复制并稳定地保存。,具有多个限制酶切点（每种限制酶切点只有一个），以便与外源基因连接。,具有标记基因，便于进行筛选。,载体,要把甲生物取出的基因送到乙生物的细胞中去，需要运输基因的载体。,第十一页，共五十一页。,最常用的基因(jyn)载体是细菌细胞质的质粒,质粒能自主复制的双链环状DNA分子，存在于细菌核区以外(ywi)，带有少量基因，其中常含有抗生素抗性基因（如四环素的抗性基因），使细菌有抗药性，一个细菌中有多个质粒。,
5、第十二页，共五十一页。,最常用的基因(jyn)载体是细菌细胞质的质粒,质粒与宿主细胞的关系：1、质粒的存在对宿主细胞无影响(yngxing)。2、质粒的复制只能在宿主细胞内完成。,第十三页，共五十一页。,第十四页，共五十一页。,4、筛选含有(hn yu)目的基因的受体细胞,1、获得目的(md)基因,2、形成重组(zhn z)DNA分子,3、将重组DNA分子导入受体细胞,5、目的基因的表达,第二节基因工程的原理和技术,基因工程的基本操作步驟,第十五页，共五十一页。,逆转录法：,信使(xnsh)RNA,DNA单链,DNA双链(基因(jyn),直接(zhji)合成法：,组成蛋白质的氨基酸序列,信使R
6、NA核苷酸序列,基因单核苷酸序列,基因双链,、获得目的基因,（1）化学合成法（目的基因的序列巳知）,第十六页，共五十一页。,人工合成(rn n h chn),(基因(jyn)比较小),DNA合成(hchng)仪,第十七页，共五十一页。,（2）用聚合酶链式反应(lin sh fn yng)(PCR)扩增目的基因,第十八页，共五十一页。,PCR反应(fnyng),重复(chngf)13步2530轮,目的DNA片段(pin dun)扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链与引物复性,DNA变性形成2条单链,子链延伸DNA加倍,第十九页，共五十一页。,第二十页，共五十一页。,（3）从基因文库中分离
7、(fnl)：,目的基因(jyn)的脱氧核苷酸序列是未知的，可以从基因文库中找到目的基因（酶切）。,（2）用聚合酶链式反应(lin sh fn yng)(PCR)扩增目的基因,第二十一页，共五十一页。,基因组文库(wnk)的构建模式图,通过对受体菌的培养而储存(chcn)基因,第二十二页，共五十一页。,2、形成重组(zhn z)DNA分子,用相同的限制性核酸(h sun)内切酶分别切割目的基因和载体；,目的(md)基因与载体的结合过程基因重组,用DNA连接酶将目的基因和载体连接在一起，形成重组DNA分子（或重组质粒）。,第二十三页，共五十一页。,3、将重组(zhn z)DNA分子导入受体细胞,将
8、重组(zhn z)DNA分子导入受体细胞并使之扩增。,a、为使重组的质粒更容易(rngy)进入大肠杆菌，用氯化钙处理大肠杆菌，增加大肠杆菌细胞壁的通透性。,a.如要获得目的基因的表达产物，通常以大肠杆菌等无害易得的细菌为受体。b.如要改良某种生物的性状时，要以改良的生物细胞为受体。,问题：谁是受体？,第二十四页，共五十一页。,3、将重组(zhn z)DNA分子导入受体细胞,将重组(zhn z)DNA分子导入受体细胞并使之扩增。,1、受体为植物细胞：农杆菌介导法 基因(jyn)枪法 花粉管道法,b.如要改良某种生物的性状时，要以改良的生物细胞为受体。,2、受体为动物细胞：基因枪法 显微注射法,第
9、二十五页，共五十一页。,1.将目的基因导入植物(zhw)细胞,农杆菌转化(zhunhu)法基因枪法花粉管通道法,第二十六页，共五十一页。,（1）农杆菌(gnjn)转化法,特点：易感染(gnrn)双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染(gnrn)能力,原理：Ti质粒上的T-DNA可以转移(zhuny)到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。,第二十七页，共五十一页。,转化(zhunhu)过程:,Ti质粒目的(md)基因,构建(u jin),表达载体,植物细胞,植物细胞染色DNA,新性状,农杆菌,第二十八页，共五十一页。,基因枪法(qingf)又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动
10、力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。,（2）基因(jyn)枪法,适用(shyng)于单子叶植物,第二十九页，共五十一页。,（3）花粉(hufn)通道法,植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱(huzh)直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。,适用(shyng)于被子植物,第三十页，共五十一页。,胚珠(pi zh),花药(huyo),花丝(hu s),柱头,花柱,子房壁,子房,雄蕊,雌蕊,第三十一页，共五十一页。,2.将目的(md)基
11、因导入动物细胞,（1）方法(fngf)：显微注射法（将基因表达载体提纯，用显微仪注射到 受精卵中）,思考(sko)：为什么要用受精卵而不用体细胞？,第三十二页，共五十一页。,（2）操作程序:,提纯含目的(md)基因表达载体,取受精卵,显微(xin wi)注射,移植(yzh)到子宫,受精卵发育,新性状动物,第三十三页，共五十一页。,4、筛选含有(hn yu)目的基因的受体细胞,尽管使用了大量的受体细胞，但真正导入了重组DNA分子的受体细胞很少，因此必须(bx)将它从中检测出来。,筛选的方法主要依赖于质粒中的抗性基因所表达(biod)的产物进行筛选。,第三十四页，共五十一页。,生长(shngzhn
12、g)被抑制,供体DNA,正常(zhngchng)生活,第三十五页，共五十一页。,问题1：在受体细胞中检测到含有目的基因(jyn)，能说明转基因成功吗？,不能。还要看最后该目的基因是否(sh fu)在受体细胞表达。,5、目的(md)基因的表达,问题2：如何检测？,检测的方法主要看导入的目的基因是否表达出产物，或要看受体生物是否表现出相应的性状。,基因工程是否获得成功，最重要的是要看目的基因是否在受体细胞中得到表达。,第三十六页，共五十一页。,产物(chnw)的检测,细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落(jnlu)，检测菌落(jnlu)中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落(jnl
13、u)，保留有表达产物的进一步培养、研究。,第三十七页，共五十一页。,如用棉叶饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未导入目的基因或导入的目的基因未表达(biod)。如虫吃后中毒死亡，则说明导入了抗虫基因并得到表达(biod)。,性状(xngzhung)的检测,第三十八页，共五十一页。,如转入了人胰岛素原基因的大肠杆菌，可以(ky)合成人胰岛素原。经进一步加工后可获得具有生物活性的胰岛素。,如转入了人胰岛素原基因的酵母菌，是否(sh fu)需要进一步加工？,第三十九页，共五十一页。,1.不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能复制 B、有多个限制酶切点 C、具有(jyu)标记基因 D、它是环
14、状DNA,D,练习(linx),第四十页，共五十一页。,2.有关基因工程的叙述中，错误的是 A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、限制性核酸(h sun)内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、一种限制酶只能识别一种特定的脱氧苷酸 序列,A,第四十一页，共五十一页。,3.有关基因工程的叙述(xsh)正确的是 A、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体 D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料,D,第四十二页，共五十一页。,4.基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的
15、步骤是 A、人工合成目的基因 B、目的基因与运载体结合(jih)C、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测和表达,C,第四十三页，共五十一页。,1（全国卷）采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列(xili)导入目的基因的作法正确的是（）将毒素蛋白注射到棉受精卵中将编码毒素蛋白的DNA序列，注射到棉受精卵 中将编码毒素蛋白的DNA序列，与质粒重组，导 入细菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行 组织培养将编码毒素蛋白的DNA序列，与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵A B C D,C,第四十四页，共五十一页。,2（2009年浙江卷）下列关于基因工程的叙述，错误 的是()A目的基因和受体细胞均可
16、来自动、植物或微生物 B限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的工 具酶 C人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无 生物活性 D载体(zit)上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞 和促进目的基因的表达,D,第四十五页，共五十一页。,3(2010浙江卷)在用基因工程技术构建抗除草剂的转基因烟草过程中，下列操作错误的是()A用限制性核酸内切酶切割烟草花叶病毒的核酸B用DNA连接酶连接经切割的抗除草剂基因(jyn)和载体C将重组DNA分子导入烟草原生质体D用含除草剂的培养基筛选转基因烟草细胞,A,第四十六页，共五十一页。,4（2011浙江卷）将ada(腺苷酸脱氨酶基因）通过质粒pET28b导入大肠杆菌并成功表达腺苷酸脱氨酶。下列叙述错误(cuw)的是（）A.每个大肠杆菌细胞至少含一个重组质粒 B.每个重组质粒至少含一个限制性核酸内切酶识别位点 C.每个限制性核酸内切酶识别位点至少插入一个ada D.每个的ada至少表达一个腺苷酸脱氨酶分子,C,第四十七页，共五十一页。,6(2012浙江卷）天然的玫瑰没有蓝色花，这是由于缺少控制蓝色色素合成的基因B，而开蓝色花的矮牵牛中存在序列已知的
