1、流式细胞仪分析技术(jsh)及应用,第一页，共七十七页。,第一节 概述 一、工作原理 二、散射光的测定(cdng)三、荧光测量 四、细胞分选原理,第二节 数据(shj)的显示与分析 一、参数 二、数据显示方式 三、设门分析技术,第三节 流式细胞仪免疫分析的技术要求一、免疫检测样品制备二、免疫分析中常用的荧光染料与标记染色三、免疫胶乳颗粒(kl)的应用四、流式细胞免疫学技术的质量控制,第二页，共七十七页。,第四节 流式细胞术在免疫学检查中的应用 一、淋巴细胞及其亚群的分析 二、淋巴细胞功能分析 三、淋巴(ln b)造血系统分化抗原及白血病免疫分型 四、肿瘤耐药相关蛋白分析 五、AIDS病检测中的
2、应用 六、自身免疫性疾病相关HLA抗原分析 七、移植免疫中的应用,思考题小结(xioji),第三页，共七十七页。,流式细胞术(flow cytometry,FCM)是以流式细胞仪为检测手段(shudun)的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。,第四页，共七十七页。,流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针(tn zhn)的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。,细胞不被破坏(phui)，测量快速、大量、准确、灵敏、定量,流式细胞术的特点(tdin),第五页，共七十七页。,流式细胞仪是测量(
3、cling)染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速测量并可分类收集的高技术。,第一节 概述(i sh),第六页，共七十七页。,第七页，共七十七页。,流式细胞仪常检测(jin c)的细胞特性,第八页，共七十七页。,采用激光作为激发(jf)光源，保证其具有更好的单色性与激发(jf)效率；利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检测的灵敏度和特异性；用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确性。,一、工作(gngzu)
4、原理,第九页，共七十七页。,（1）液流系统(xtng)（2）光学系统（3）数据处理系统,1.流式细胞仪的基本(jbn)结构：,第十页，共七十七页。,由样本和鞘液组成待测细胞 单个细胞的悬液 荧光染料标记的单抗对其染色 受清洁气体压力 从样品管进入流动室形成样本流鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于(chy)喷嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。,（1）液流系统(xtng),第十一页，共七十七页。,液流系统(xtng)示意图,第十二页，共七十七页。,FCM的液流系统(xtng)（如何形成单个细胞流）,样本(yngbn)管,鞘液管,第十三页，共七十
5、七页。,激光光源：气冷(q ln)式氩离子激光器分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长光束成形器：两十字交叉放置的透镜透镜组：形成平行光，除去室内光滤片：长通、短通、带通光电倍增管：FS,SS（散射光），FL1,FL2,FL3,FL4（荧光）,（2）光学系统,第十四页，共七十七页。,光学系统示意图,第十五页，共七十七页。,主要由计算机及其软件(run jin)组成,（3）数据处理系统,第十六页，共七十七页。,基本工作(gngzu)原理,第十七页，共七十七页。,基本(jbn)过程,第十八页，共七十七页。,流式细胞仪与显微镜的区别(qbi),第十九页，共七十七页。,细胞在液柱中与激光束相交时向
6、周围360立体角方向散射的光线(gungxin)信号，它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗粒折射等有关，主要分为前向散射光和侧向散射光。,二、散射光的测定(cdng),第二十页，共七十七页。,第二十一页，共七十七页。,前向散射光（forward scatter,FS）：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度(jiod)(0.510)向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。,第二十二页，共七十七页。,前向散射光示意图,第二十三页，共七十七页。,侧向散射光（side scatter,SS）：激光束照射(zhosh)细胞时，光以90角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属
7、性。,第二十四页，共七十七页。,侧向(c xin)散射光示意图,第二十五页，共七十七页。,测得的FS与SS信号通过计算机处理，可得到FS-SS图，由此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进行(jnxng)分析或分选。此为血细胞分类的基本原理，但不能分析表面分子。,淋巴细胞,单核细胞,中性(zhngxng)粒细胞,光散射测量最有效(yuxio)用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群,第二十六页，共七十七页。,荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分(qfn)开，
8、送入不同的光电倍增管。选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。线性放大器和对数放大器,三、荧光(ynggung)测量,第二十七页，共七十七页。,荧光染料(rnlio)的特性,激发(jf)波长(EXCITING)发射波长(EMISSION),第二十八页，共七十七页。,第二十九页，共七十七页。,荧光(ynggung)补偿,第三十页，共七十七页。,通过流式细胞仪进行细胞分选主要(zhyo)是在对具有某种特征的细胞需进一步培养和研究时进行的。,四、细胞(xbo)分选原理,第三十一页，共七十七页。,压电晶体(jngt),产生(chnshng)机械振动,不充电(chng din),充电,
9、（一）分选基本原理,第三十二页，共七十七页。,分选速度(sd)：单位时间内分选的细胞数量。与悬液中细胞的含量成正比。分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞的百分率。分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。与分选速度成反比。,（二）分选的技术(jsh)要求,第三十三页，共七十七页。,参数：FS,SS,FL数据(shj)显示方式（单参数直方图、双参数散点图、二维等高图、假三维等高图、三参数散点图）设门分析技术,第二节 数据(shj)的显示与分析,第三十四页，共七十七页。,
10、FS：反映颗粒的大小SS：反映颗粒的内部结构复杂程度FL：反映颗粒被染上的荧光数量(shling)多少,一、参数(cnsh),第三十五页，共七十七页。,单参数(cnsh)直方图双参数直方图:点图 二维等高图 假三维等高图三参数直方图多参数分析,直分析(fnx)方图,设门分析(fnx):REGION和GATE设置,二、数据显示方式,第三十六页，共七十七页。,由一维参数(散射光或荧光(ynggung)与颗粒计数(COUNT)构成，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。,（一）单参数(cnsh)直方图,第三十七页，共七十七页。,单参数(cnsh)直方图,第三十八页，共七十七页。,双参数直方图：纵
11、轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数，根据这两个参数就可以确定(qudng)细胞在图上的表达位置。双参数信号通常采用对数信号，最常用的是点密图，在图中，每个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。,（二）双参数(cnsh)直方图,第三十九页，共七十七页。,1.双参数(cnsh)直方图点图,第四十页，共七十七页。,双参数(cnsh)直方图点图,第四十一页，共七十七页。,2.二维等高图,由类似地图上的等高线组成，其本质也是双参数直方图。等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即“等高”。曲线层次(cngc)越高(越里面的线)所代表的细胞数愈多。等高
12、线越密集则表示细胞数变化率越大。,第四十二页，共七十七页。,二维等高图,第四十三页，共七十七页。,3.假三维等高图,第四十四页，共七十七页。,（三）三参数(cnsh)直方图,第四十五页，共七十七页。,多参数(cnsh)分析：当细胞标记了多色荧光，被激发光激发后，得到的荧光信号和散射光信号可根据需要进行组合分析。,（四）流式细胞仪的多参数(cnsh)分析,第四十六页，共七十七页。,Gate设置：指在某一张选定参数的直方图上，根据该图的细胞(xbo)群分布选定其中想要分析的特定细胞(xbo)群，并要求该样本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞(xbo)的分布情况。,根据门的形状又分为(fn wi
13、)了线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意形状门和十字门。,三、设门分析(fnx)技术,第四十七页，共七十七页。,A 淋巴细胞B 单核细胞C 中性(zhngxng)粒细胞,A、B、C均为任意(rny)门,第四十八页，共七十七页。,线性门,第四十九页，共七十七页。,Region设置:区阈（region,R）与门(gate,G)是两个相关(xinggun)的概念，区阈可与门对应，但是也可以包含于门。,第五十页，共七十七页。,D1 CD4+/CD3-D2 CD4+/CD3+D3 CD4-/CD3-D4 CD4-/CD3+,如十字门分析(fnx)时，起就可以由四个区域构成，即G=D1+D2+D3+D4
14、。,第五十一页，共七十七页。,样本制备标记染色(rns)液相芯片技术 质量控制,第四节 流式细胞仪免疫分析的技术(jsh)要求,第五十二页，共七十七页。,外周血淋巴细胞样品的制备分离单个核细胞(xbo)培养细胞的样品制备 蛋白酶消化 机械吹打 使贴壁细胞脱落 洗涤 尼龙网过滤,一、免疫检测样品(yngpn)制备,第五十三页，共七十七页。,新鲜实体组织单细胞悬液的制备(zhbi)机械法酶处理法化学试剂处理法表面活性剂处理法单细胞悬液的保存深低温保存法（一年）乙醇或甲醇保存法（2周）甲醛或多聚甲醛保存法（2月）,第五十四页，共七十七页。,适用条件:有较高的量子产额和消光系数对488nm的激发光波长
15、有较强的吸收发射(fsh)光波长与激发光波长间有较大的波长差易与标记单抗结合而不影响抗体的特异性,二、常用的荧光(ynggung)染料与标记染色,第五十五页，共七十七页。,激光(jgung),细胞(xbo)悬液,异硫氰酸荧光(ynggung)素,得州红,能量传递复合染料,藻胆蛋白类,（一）几种常见的荧光染料,第五十六页，共七十七页。,常用(chn yn)的几类荧光染料,第五十七页，共七十七页。,用化学法将两种不同激发波长的染料结合在一起，在488nm激发光照射下，通过一个(y)荧光染料被激发后产生的发射波长再激发另一荧光染料产生荧光信号，从而检测到该特定荧光信号。,能量(nngling)传递复
16、合染料,第五十八页，共七十七页。,488nm,575nm,670nm红色(hngs)荧光,花青(hu qn)苷5,藻红蛋白(dnbi),能量传递复合染料机制,第五十九页，共七十七页。,荧光染料与细胞成分的四种结合方式结构亲和式嵌入结合共价键结合荧光标记(bioj)抗体特异性结合免疫荧光标记方法直标:干扰少,但需购买多种单抗间标:步骤多,干扰多,不需标记多种抗体组合标记,（二）免疫荧光标记(bioj),第六十页，共七十七页。,免疫胶乳颗粒的应用即液相芯片技术是把微小(wixio)的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色，把针对不同检测物的乳胶微球混合后再加入待标本，在悬液中与微粒进行特异性地结合，经激光照射后不同待测特产生不同颜色，并可进行定量分析。因检测速度极快，所以又有“液相芯片”之称。,三、免疫胶乳(jior)颗粒技术的应用,第六十一页，共七十七页。,微小的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色（固相芯片是用探针在芯片上的坐标位置(wi zhi)给基因的特异性编码；而液相芯片则是用颜色来编码）,第六十二页，共七十七页。,第六十三页，共七十七页。,通过对标记不同荧光(ynggung)素分子的
