1、细菌感染的检测,第一页，共四十七页。,实验二 细菌的生长繁殖、消毒与灭菌,一、讨论：1、消毒灭菌的方法、实验室生物平安2、细菌的人工培养：培养基、细菌培养技术、细菌生长现象二、示教：1、消毒灭菌的常用方法2、药敏实验3、培养基制备、种类、用途4、细菌生长现象观察三、操作：细菌的接种液体、半固体、固体培养基,第二页，共四十七页。,(一消毒灭菌方法、实验室生物平安,1.常用术语消毒(disinfection)：利用理化因素杀死物体或环境中病原微生物的措施。并不一定能杀死含芽胞的细菌或非病原微生物灭菌(sterilization)：利用理化因素杀死物体上所有微生物的过程，包括芽胞。无菌操作asept
2、ic technique)：防止细菌进入人体或其他物品的操作技术。,第三页，共四十七页。,2常用方法,物理消毒灭菌法：热力灭菌法：干热灭菌法、湿热灭菌法 辐射杀菌法：电离辐射-X、射线 非电离辐射-紫外线、日光、微波 滤过除菌法：滤过除菌法 枯燥低温抑菌法：抑菌和灭菌化学消毒灭菌法：生物消毒灭菌法,第四页，共四十七页。,热力灭菌法,干热灭菌燃烧、烧灼、红外线干烤160170/2h,第五页，共四十七页。,热力灭菌法,湿热灭菌巴氏消毒法：6230min 或72 30sec煮沸法 30min流动蒸气消毒法间歇蒸气灭菌法 高压蒸气灭菌法：121,1.05Kg/cm2(15个大气压),20min,第六页
3、，共四十七页。,辐射杀菌法,电离辐射：X、射线原理:通过产生OH、O2等活性游离基进行杀菌；通过破坏DNA的结构导致菌体死亡非电离辐射：紫外线、微波、超声波、日光,第七页，共四十七页。,辐射杀菌法：非电离辐射,.紫外线：200 300nm日光(最佳答案：265266nm)原理：导致DNA分子构型改变DNA复制出现过失用途：只用于空气和物品外表的消毒注意防护.微波：细菌体内的蛋白质、核酸等分子在微波场下高速旋转、振动，细菌蛋白质凝固、核酸变性而死亡。常用于对非金属器械的消毒，优点是无污染而且迅速。.超声波是指频率大于20kHz的声波，其频率高，波长短，定向性好，穿透力强。原理：空化作用用途：液体
4、或可放置液体中不影响其性能的物品,第八页，共四十七页。,滤过除菌法,贝克菲滤器 蔡氏滤器 玻璃滤器 膜滤器孔径 0.22um-0.45um除菌空气过滤器:无菌棉花、活性炭及细玻璃纤维等可对空气进行过滤除菌,第九页，共四十七页。,2、化学消毒灭菌法,常用消毒剂(disinfectants)的杀菌机制使菌体蛋白变性或凝固干扰微生物酶系统和影响其代谢损伤细胞壁、细胞膜,环氧乙烷消毒设备,第十页，共四十七页。,医学上常用消毒剂类型作用机制及种类,第十一页，共四十七页。,化学消毒灭菌法,第十二页，共四十七页。,医疗器械物品的消毒灭菌,高危器械物品 需进入无菌组织的物品。所有这些物品都应该灭菌。中危器械物
5、品 不进入无菌组织但接触黏膜的器械。采用消毒即可。低危器械物品 只接触未损伤皮肤但不进入无菌组织和不接触黏膜的物品。一般用后清洗、消毒即可。快速周转的医疗器械,第十三页，共四十七页。,室内空气消毒灭菌,a.物理消毒法 紫外线照射1.5W/m3，1h最常用；滤过除菌：空气通过孔径小于0.2 m的高效过滤装置以除去细菌和带菌尘埃b化学消毒法 包括化学消毒剂喷雾和熏蒸过氧乙酸喷雾、熏蒸；过氧化氢喷雾；二氧化氯溶液喷洒；中草药点燃烟熏,第十四页，共四十七页。,手和皮肤的消毒,用肥皂和流动水经常并正确洗手病原微生物污染时应用消毒剂消毒,第十五页，共四十七页。,消毒灭菌的方法,热力灭菌法,辐射杀菌法,滤过
6、除菌法,枯燥与低温抑菌法,干热灭菌法,湿热灭菌法,物理消毒灭菌法,化学消毒灭菌法,高效消毒剂,中效消毒剂,低效消毒剂,第十六页，共四十七页。,3、实验室生物平安,生物平安biosafety是生物技术平安的简称狭义的指现代生物技术的研究、开发、应用及转基因生物可能对生物多样性、生态环境和人类健康产生潜在的危害。广义的指与生物有关的各种因素 对社会、经济、人类健康及生态 环境所产生的危害或潜在风险。,第十七页，共四十七页。,1生物平安的内容,转基因生物、外来入侵物种、环境污染病原微生物感染性疾病、人畜共患疾病、动物疾病、食源性疾病、医院感染实验室泄漏：生物武器、生物恐怖遗传资源保护合成生物技术转基
7、因及其它新型生物技术,第十八页，共四十七页。,事故引发的生物危害,是由进行病原体研究、教学、诊断、治疗、生物制品研发和生产等机构的事故导致病原体泄漏，引发了传染病爆发的生物灾害。这类生物灾害往往影响较大，危害范围小，造成局部灾害大，持续短1979年，苏联国防微生物与病毒研究所炭疽芽孢干粉制剂车间的加压系统爆炸，约10公斤芽孢粉剂泄漏，造成斯维尔德洛夫斯克城数百人伤亡。2003年9月新加坡国立卫生研究院BSL3实验室发生研究人员感染SRAS病毒的事故。2003年12月我国台湾省一实验室也发生了研究人员感染SRAS病毒的事故，2004年4月我国国家CDC的专业实验室发生了SARS的实验室人员感染。
8、,第十九页，共四十七页。,2如何实现实验室生物平安？,加强管理，标准行为，消除隐患，确保平安 如何管？依法、标准管理 管那些？病原微生物、实验室设立、风险评估、实验活动、实验 装备、废弃物、人员,第二十页，共四十七页。,病原微生物分类管理,第二十一页，共四十七页。,病原微生物实验室的分级管理,第二十二页，共四十七页。,二细菌的人工培养：,培养基的概念、种类、用途细菌培养技术细菌生长现象,第二十三页，共四十七页。,1.培养基的概念、种类、用途、制备,培养基culture medium):是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养物制品。根底培养基 增菌培养基 选择培养基 鉴别培养基
9、 厌氧培养基 根据物理性状：液体、固态、半固体,根据用途,第二十四页，共四十七页。,牛肉膏 3.0g 蛋白胨 10.0g氯化氯化钠NaCL 5.0g磷酸二氢钾KH2PO4 1.0g琼脂 15.0g蒸馏水 1000mL混匀，加热溶解，调PH至7.6分装，112kPa高压灭菌15min，冷却至45倾注灭菌平板。,普通琼脂平板制备,第二十五页，共四十七页。,2.细菌的培养方法,别离培养：划线接种在固体培养基的外表，因划线的分散作用，使许多原混杂的细菌在固体培养基外表上散开。纯培养：挑取一个菌落，移种到另一培养基中，可生长出来的大量的纯种细菌。发酵培养：在适宜的条件下，发酵罐中大量培养微生物细菌、真菌
10、等细胞和生产代谢产物的工艺过程。,第二十六页，共四十七页。,别离培养：,第二十七页，共四十七页。,菌落(colony),纯培养：,第二十八页，共四十七页。,菌种筛选,摇瓶试验,发酵罐中试验,发酵培养由实验室研究到产业化的过程,发酵生产,第二十九页，共四十七页。,3.培养基中生长现象：液体培养基,菌膜生长,沉淀生长,混浊生长,混浊：大多数细菌 沉淀：链状生长的细菌菌膜：专性需氧菌，如结核杆菌、枯草杆菌。,第三十页，共四十七页。,有鞭毛的细菌：试管中沿穿刺线呈羽毛状或云雾状混浊生长；平皿中迁徙样生长无鞭毛细菌：沿穿刺线线状生长或无扩散生长现象用于细菌的动力试验,无动力,有动力,迁徙生长,3.培养基
11、中生长现象：半固体培养基,第三十一页，共四十七页。,菌落colony：在固体培养基上，一般经1824小时培养后，单个细菌即可繁殖成一堆肉眼可见的细菌集团。不同细菌菌落在大小、形状、颜色、气味、透明度、外表光滑/粗糙、湿润/枯燥、边缘整齐、溶血性不同,3.培养基中生长现象：固体培养基,第三十二页，共四十七页。,细菌的菌落一般可分为三种：,光滑型菌落(smooth colony，S型菌落：新别离的细菌大多呈光滑型菌落，外表光滑、湿润、边缘整齐。粗糙型菌落(rough colony，R型菌落：菌落外表粗糙、枯燥、呈皱纹或颗粒状，边缘大多不整齐。黏液型菌落mucoid colony，M型菌落：菌落黏稠
12、、有光泽，似水珠样。细菌多有厚荚膜或丰富粘液层。,粗糙型菌落,黏液型菌落,光滑型菌落,第三十三页，共四十七页。,水溶性色素如铜绿假单胞菌 脂溶性色素如金黄色葡萄球菌,铜绿假单胞菌,金黄色葡萄球菌,第三十四页，共四十七页。,4.人工培养细菌的用途,医学感染性疾病的病原学诊断 细菌学研究 生物制品的制备工农业生产基因工程中应用,第三十五页，共四十七页。,二、示教：,1、消毒灭菌的常用方法:物理-热力干、湿热各两个过滤器3-4种、冰箱、紫外线两个、超生波 化学-高、中、低效消毒剂各类型2-3个代表；2、药敏实验：纸片法3、培养基的种类：见前解释、观察实物4、细菌生长现象观察：见前、观察实物,第三十六
13、页，共四十七页。,药敏实验：纸片法,第三十七页，共四十七页。,Zone Interpretive Criteria(mm),第三十八页，共四十七页。,三、操作：细菌的接种培养,液体培养基 固体斜面培养基 半固体培养基,固体平皿培养基,第三十九页，共四十七页。,1.固体平皿培养基别离接种方法,右手执笔式握持接种环，在酒精灯火焰上烧灼接种环，待冷，取待测菌液一环。左手抓握琼脂培养基平皿，用手掌将平皿的底固定，用手指将平皿的盖略抬起一些，进行接种。持接种环在琼脂外表的1区涂布，划线时接种环与琼脂外表呈 3040的角度轻轻接触，利用腕力，切忌划破琼脂外表。烧灼接种环，待冷后，将接种环在2区、3区划线数
14、次，各线条间隔要小，但不能重叠。划完3区不需烧灼接种环，在4区作连续划线，如此反复至划完整个平皿如图3。,第四十页，共四十七页。,图1 接种环的握持方法,图2 平皿的握持方法,第四十一页，共四十七页。,接种完毕，盖好平皿盖，在平皿底玻璃上用记号笔注明标本名称、接种时间、接种者等。然后将平皿的底朝上，放置在37孵箱内孵育24h。取出后观察琼脂外表的菌落分布情况，注意观察最后12区内是否别离出单个菌落，并观察记录菌落特征如菌落大小、形状、透明度、色素等情况。,第四十二页，共四十七页。,2.固体斜面培养基接种方法,第四十三页，共四十七页。,3.半固体培养基接种方法,右手持接种针，灭菌冷却以接种针挑取
15、菌种垂直刺入半固体培养基的中心，然后循原路退出。半固体琼脂培养基穿刺接种：主要是观察细菌有无动力。,第四十四页，共四十七页。,4.液体培养基接种方法,挑取少量菌苔或菌液，伸入待接种的培养基管内，在接近液面的管壁上轻轻研磨，并沾取少许培养液调和，使菌混合于其中,第四十五页，共四十七页。,【思考题】,一、细菌的生长繁殖与人工培养在医疗实践中有何意义？二、临床常用化学消毒剂的种类、作用机制与用途？三、以实验小组为单位，预习化脓性球菌别离鉴定并设计“化脓性球菌别离鉴定方案要求小组长切实负责，小组成员分工进行文献及相关资料查阅收集、最后归纳总结。,第四十六页，共四十七页。,内容总结,细菌感染的检测。细菌感染的检测。无菌操作aseptic technique)：防止细菌进入人体或其他物品的操作技术。滤过除菌法：滤过除菌法。枯燥低温抑菌法：抑菌和灭菌。高压蒸气灭菌法：121,1.05Kg/cm2(15个大气压),20min。原理：导致DNA分子构型改变DNA复制出现过失。用途：液体或可放置液体中不影响其性能的物品。只接触未损伤皮肤但不进入无菌组织和不接触黏膜的物品。,第四十七页，共四十七页。,
