1、兽医生物制品学-分论,大肠杆菌,小组成员：余兆鸿 罗洪瑶 胡国帅 黄荣浩,第一页，共五十二页。,第一章 大肠杆菌,大肠杆菌是革兰氏阴性杆菌。多数是肠道的正常菌群，少数为病原菌。,第二页，共五十二页。,埃希菌属 Escherichia),埃希菌属有5个种，其中最重要的是大肠埃希菌俗称大肠杆菌E.coli)，是最常见的临床别离菌。,第三页，共五十二页。,形态特征：,大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢的直杆菌，大小0.40.7umx23um，两端钝圆，散在或成对，大多数菌株周生鞭毛，但也有无鞭毛或丧失鞭毛的变异株。,原子力显微镜图片,第四页，共五十二页。,第五页，共五十二页。,第六页，共五十二页。,染色特性
2、：,碱性染料对本菌有良好着色性，革兰氏染色法被染成红色。,第七页，共五十二页。,培养及生化特性：,本菌为兼性厌氧菌，在普通肉汤培养基上生长良好，最适生长温度为37，最适生长pH为7.27.4。,1 2 3,第八页，共五十二页。,在麦康凯琼脂上形成红色菌落;在伊红美蓝琼脂上产生黑色带金属闪光的菌落;在SS琼脂上一般不生长或生长较差，生长者呈红色。在血液琼脂上大肠杆菌生长茂盛，一些致病性菌株在菌落周围形成-溶血。,麦康凯培养基,伊红美蓝培养基,血液培养基,第九页，共五十二页。,本菌能发酵多种碳水化合物产酸产气。大多数菌株可迅速发酵乳糖。约半数菌株不分解蔗糖，几乎均不产生硫化氢，不分解尿素。TSI三
3、糖铁培养基上反响呈黄色。,第十页，共五十二页。,抗原及血清型,大肠杆菌抗原主要有O、K和H三种。O抗原：173种K抗原：103种H抗原：60种由此，有人认为自然界大肠杆菌的血清型可高达数万种。,第十一页，共五十二页。,鞭毛抗原H,菌体抗原O,K或Vi抗原,第十二页，共五十二页。,根据对大肠杆菌抗原的鉴定，可用O:K:H排列表示其血清型抗原结构式。如O8:K23L:Hl9，即表示该菌具有O抗原8，L型K抗原23，H抗原为19。对含有蛋白质性黏附素抗原的菌株，其黏附素抗原应并列K抗原之后。如O8:K87，K88:Hl9中K88即为黏附素抗原F4。,血清型的表示：,第十三页，共五十二页。,致病性,根
4、据毒力因子与发病机制的不同，Gyles认为与动物疾病有关的病原性大肠杆菌可分为五类:1、产肠毒素大肠杆菌(ETEC)2、产类志贺毒素大肠杆菌(SLTEC)3、肠致病性大肠杆菌(EPEC)4、败血性大肠杆菌(SEPEC)5、尿道致病性大肠杆菌(UPEC),第十四页，共五十二页。,ETEC系一类致人和幼畜(初生仔猪、犊牛、羔羊及断奶仔猪)腹泻最常见的病原性大肠杆菌，其致病力主要由黏附素性菌毛和肠毒素两类毒力因子构成，二者密切相关且缺一不可。初生幼畜被ETEC感染后常因剧烈水样腹泻，发病率和死亡率均很高,如仔猪黄痢。,1、产肠毒素大肠杆菌(ETEC),第十五页，共五十二页。,ETEC 能够引起腹泻，
5、其致病因素主要是定居因子和肠毒素。ETEC 不侵入上皮细胞，而是借助定居因子吸附到小肠黏膜外表进行繁殖，并产生一种或多种肠毒素，引起小肠分泌大量液体，导致机体腹泻。,产肠毒素大肠杆菌 ETEC 的致病机理,第十六页，共五十二页。,粘附素性菌毛系人和动物ETEC的一类特有菌毛，因其能粘附于宿主的小肠上皮细胞，故又称其为粘附素或定居因子。迄今，在动物ETEC中已发现的黏附素主要有F4(K88)、F5(K99)、F6(987P)和F41，其次为F42和F17。,第十七页，共五十二页。,肠毒素是ETEC在体内或体外生长时产生并分泌到胞外的一种蛋白质性毒素，按其对热的耐受性不同可分为不耐热肠毒素(LT)
6、和耐热肠毒素(ST)二种。在动物ETEC中，只有猪源F4+株能同时产生LT和ST，其他菌株仅产ST。,第十八页，共五十二页。,2、产类志贺毒素大肠杆菌(SLTEC),又称产Vero细胞毒素大肠杆菌(VTEC)，系一类在体内或体外生长时可产生类志贺毒素 的病原性大肠杆菌。在动物，SLTEC可致猪的水肿病，以头部、肠系膜和胃壁浆液性水肿为特征，常伴有共济失调、麻痹或惊厥等神经病症，发病率较低但致死率很高。,第十九页，共五十二页。,引起猪水肿病的SLTEC两类毒力因子：1粘附性菌毛：在1990年Bertsching等首次报道，从致猪水肿病的大肠杆菌别离出F18，是猪水肿病的SLTEC菌株的一个重要的
7、毒力因子，它有助于细菌在猪肠黏膜上皮细胞定居和繁殖。2致水肿病2型类志贺毒素(SLT-2e或SLT-2v)：系引起猪水肿病的SLTEC所产生的一种蛋白质性细胞毒素。,第二十页，共五十二页。,微生物学诊断：,动物致病性大肠杆菌的别离与鉴定程序如下：,第二十一页，共五十二页。,几种常见动物大肠杆菌病发病特点,整体看，发病以幼畜为主,第二十二页，共五十二页。,仔猪大肠杆菌病,第二十三页，共五十二页。,主要是通过消化道感染，其次是通过脐部感染，也有局部是通过呼吸道感染。,流行特点,发病特点及临床病症,羔羊发生一种以口鼻流沫、呼吸困难和胸膜肺炎为主要特征的疾病。发病的羔羊据统计有121只，病羊多为420
8、日龄的羔羊，死亡54只，死亡率约44.6%，病程短，如不及时治疗，约30min到数小时便死亡。发病的羔羊在刚开始时体温升高，达4142，精神委顿，食欲不振，腹部胀气，继之出现呼吸困难，脉搏快而弱，口流白沫，鼻流黏液，运动失调，卧地磨牙，头弯向一侧，最后在昏迷中死亡，很少见有腹泻病羔。,羔羊大肠杆菌病,第二十四页，共五十二页。,本病一年四季均可发生，但冬春季节鸡群。主要表现为严重的呼吸道病症，而夏秋季节那么以腹泻病症为主。发病范围广，死亡严重，几乎所有的养殖户的肉鸡都受到了大肠杆菌的感染。各日龄肉鸡均易感，但高发病日龄主要集中在以下二个阶段：1025日龄和35日龄以上。发病率为20%40%，平均
9、25%左右，病死率在10%以上。,鸡大肠杆菌病,发病特点,第二十五页，共五十二页。,由一定血清型(010、085、O101)的大肠杆菌引起,以拉黄、白、红痢和死亡率高为特征的一种急性传染病。,兔大肠杆菌病,由于大肠杆菌广泛地分布于自然界，仔兔出生后很短时间即可随乳汁或其他食物进人胃肠道,成为正常菌。新生仔兔在抵抗力降低或发生消化障碍时,就可能引起发病。,第二十六页，共五十二页。,防治,目前国内外已有多种多样预防幼畜腹泻的实验性或商品化菌苗。,第二十七页，共五十二页。,大肠杆菌生物制品类型：,类毒素菌苗,大肠杆菌疫苗主,乳酸菌微生态制剂大肠杆菌,大肠杆菌多克隆抗体等等,第二十八页，共五十二页。,
10、大 肠 杆 菌 疫 苗 研 究 进 展,大肠杆菌引起的腹泻已经成为一个全球性的公共卫生问题,无论在兴旺国家还是开展中国家,都受到广泛关注。目前,该病的防治以药物和疫苗为主,但因药物治疗价格昂贵,而且随着耐药菌株的增多,开展致泻性大肠杆菌疫苗具有特殊的意义。,第二十九页，共五十二页。,特别是新近出现的DNA疫苗、转基因植物疫苗和ghost疫苗技术为大肠杆菌疫苗的研制提供了许多新的思路,显示出良好的应用前景。,目前国内外研制的目标多集中于ETEC和EHEC,有的已进人期或期临床试验阶段。,第三十页，共五十二页。,1、ETEC疫苗,2DNA疫苗,1载体疫苗,2、EHEC疫苗,1多糖结合疫苗,2亚单位
11、疫苗,3、转基因植物疫苗,4、细菌ghost疫苗,研 究 进展,载体疫苗多为口服活菌苗,是利用微生物载体菌多为志贺菌和沙 门氏菌作载体,将保护性抗原基因重组到质粒上,通过平衡致死系统使其稳定存在于微生物中,或重组到微生物染色体的特定位置上,表达保护性抗原。,DNA疫苗 直接将含编码外源蛋白抗原基因的质粒DNA导人机体组织 中表达,被提呈的表达产物,与主要组织相容性复合物(MHC)结合,刺激机体产生相应的抗体和细胞毒性T淋巴细胞(cLT s),分别介导体液免疫和细胞免疫应答,即DNA疫苗。,2005年，Piller 等开展了表达大肠杆菌K99fmabriae的转基因大豆，小鼠口服后能产生抗原特异
12、的高水平抗体和CD4+T淋巴细胞。目前的研究重点在于开发出一种能生吃的植物如水果，并且尽量提高蛋白的表达量。现在有人将ETEC的LTB或者霍乱弧菌的CTB基因转入番茄植物中，虽然香蕉是最理想的植物疫苗对象，但是还有待于技术上的突破。,第三十一页，共五十二页。,大肠杆菌生物制品使用现状,目前常见的主要有仔猪、禽、羊、兔的各类大肠杆菌疫苗。,第三十二页，共五十二页。,各种动物大肠杆菌疫苗,仔猪大肠杆菌疫苗,禽大肠杆菌病疫苗,兔大肠杆菌病疫苗,羊大肠杆菌病疫苗,等等,第三十三页，共五十二页。,仔猪疫苗多为仔猪大肠杆菌病三价灭活疫苗,仔猪常用疫苗,第三十四页，共五十二页。,例如：仔猪大肠杆菌基因工程K
13、88ST1LTB三价灭活疫苗，由辽宁省益康生物制品厂生产。接种对象：仔猪使用方法：颈侧肌肉注射，每次间隔7天,三次免疫量分别为5mL、0mL、20mL；第2次和第3次免疫应分点注射。效果：,仔猪大肠杆菌疫苗,常用：,仔猪大肠杆菌基因工程K88ST1LTB三价灭活疫苗,仔猪大肠杆菌病K88-K99-987P-F41四价亚单位疫苗,第三十五页，共五十二页。,禽大肠杆菌病疫苗,一灭活疫苗：,1、灭活蜂胶苗,2、灭活油乳剂苗,3、灭活铝胶苗,二亚单位疫苗,三弱毒疫苗,1、菌毛亚单位疫苗,2、荚膜亚单位疫苗,O2(NorrChls)、O78(ChlsNorr)单价弱毒苗、,第三十六页，共五十二页。,以鸡
14、大肠杆菌病灭活疫苗制备为例：1、菌种 病原性大肠杆菌EC24、EC30、EC45、EC50、EC44麦康凯氏培养基培养2、制造要点(1)、种子繁殖：马丁肉汤培养-划线接种麦康凯氏培养基培养-接种马丁琼脂斜面培养-作为一级种子-取一级种子接种马丁肉汤培养-得到二级种子。(2)、菌液制备：用玻璃瓶或培养罐通气培养，按容积装入70%培养基及花生油消泡剂。(3)、配苗与封装：配苗：每5份菌液加1份氢氧化铝胶，同时按总量的0.005%加硫柳汞，充分震荡，28 静置，抽弃上清液浓缩成全量的60%。封装：检验合格，混合分装3、质量标准(1)、平安检验(2)、效力检验4、保存与使用 保存：28 保存，为期1a
15、。使用：颈背侧皮下注射0.5ml,1月龄鸡 接种对象：1月龄鸡以上的鸡免疫期为4个月,第三十七页，共五十二页。,附：禽大肠杆菌病,第三十八页，共五十二页。,禽大肠杆菌病是由大肠埃希氏菌的某些血清型所引起的一类疾病的总称。包括心包炎、脐炎、卵巢炎、输卵管炎、肠炎或慢性肿瘤样肉芽肿等。,第三十九页，共五十二页。,鸡大肠杆菌病,主要病型和特征：胚胎和幼稚死亡、败血症、气囊炎、包括心包炎、脐炎、卵巢炎、输卵管炎、肠炎或慢性肿瘤样肉芽肿等。,病原：肠杆菌SEPEC中O1、O2、O36、O78等血型,免疫：SEPEC的毒力因子为F11和F1黏附因子-黏附因子具有良好的抗原性，刺激机体产生特异性抗体。,疫苗
16、：目前国内外对鸡大肠杆菌病的免疫预防，主要基于以黏附素免疫为根底的含单价或多价菌毛抗原的灭火菌苗、菌毛亚单位疫苗等。,第四十页，共五十二页。,主要病症,严重的纤维素性心包炎,脐孔周围皮肤红肿鸭,卵巢感染发炎，卵泡变形鸭,鸽直肠黏膜充血、出血,小鸡输卵管膨大，内有灰白色干酪样渗出物,第四十一页，共五十二页。,【防治要点】,第四十二页，共五十二页。,大肠杆菌生物制品,与人有关如：,第四十三页，共五十二页。,国外人类腹泻的 ETEC 基因工程疫苗的研究进展以肠毒素疫苗为例,肠毒素疫苗,1984年，美国杜兰大学医学中心试验得到菌株SE12。小鼠和豚鼠试验说明，SE12菌株口服时是平安的，并能产生明显的抗毒素免疫反响。重组菌株可以作为预防伤寒和霍乱-大肠杆菌相关腹泻的二价口服活疫苗。,2001年，巴西圣保罗大学将编码ETEC鞭毛蛋白和热稳定肠毒素的基因进行连接，插入载体pCDNA3中，构建质粒pCDNA3FLA-STmt，转化至减毒沙门菌SL3261中，制成活载体疫苗。,1994年，英国坎特伯雷肯特大学将含LTB基因的重组质粒转化海产弧菌，LTB表位融合蛋白在海产弧菌中成功分泌表达，该方法可能会
