1、第一页，共八十六页。第二章第二章 酶与细胞酶与细胞(xbo)(xbo)的固定化的固定化 固定化生物技术固定化生物技术 通过化学通过化学(huxu)(huxu)或物理的手段将酶或游离细胞或物理的手段将酶或游离细胞定位于限定的空间区域内，使其保持活性并可反复定位于限定的空间区域内，使其保持活性并可反复利用。利用。第二页，共八十六页。1.1.酶是蛋白质，稳定性差（热、酸碱、有酶是蛋白质，稳定性差（热、酸碱、有机溶剂对其有影响）。机溶剂对其有影响）。2.2.不能回收，也使产物中混杂不能回收，也使产物中混杂(hnz)(hnz)酶蛋白。酶蛋白。3.3.分离纯化困难。分离纯化困难。游离游离(yul)(yul
2、)酶的缺点：酶的缺点：第三页，共八十六页。一、固定化酶和固定化细胞的定义一、固定化酶和固定化细胞的定义(dngy)(dngy)及特及特点点 1.1.固定化酶固定化酶(immobilized enzyme)(immobilized enzyme)固定在载体上并在一定空间范围内进行催化反应固定在载体上并在一定空间范围内进行催化反应的酶。的酶。第一节第一节 酶与细胞酶与细胞(xbo)(xbo)的固定化的固定化第四页，共八十六页。什么什么(shn me)是固定化酶是固定化酶？水溶性酶水溶性酶水不溶性载体水不溶性载体(zit)水不溶性酶水不溶性酶（固定化酶）（固定化酶）固定化技术固定化技术(jsh)第五
3、页，共八十六页。优点：优点：(1)(1)可提高稳定性。可提高稳定性。(2)(2)能回收能回收(hushu)(hushu)，易与产物分离，可反复使，易与产物分离，可反复使用。用。缺点：缺点：(1)(1)存在扩散限制。适于催化小分子物质。存在扩散限制。适于催化小分子物质。(2)(2)酶活性下降。酶活性下降。第六页，共八十六页。2.2.固定化细胞（固定化细胞（immobilized cellimmobilized cell）固定在载体上并在一定空间固定在载体上并在一定空间(kngjin)(kngjin)范围内范围内进行生命活动（生长、繁殖、新陈代谢）的细进行生命活动（生长、繁殖、新陈代谢）的细胞。胞
4、。第七页，共八十六页。优越性：优越性：(1)(1)降低成本，省去酶的分离纯化工作降低成本，省去酶的分离纯化工作;(2)(2)既可作为既可作为(zuwi)(zuwi)单一酶，也可作为单一酶，也可作为(zuwi)(zuwi)复合复合酶系酶系 完成部分代谢过程。完成部分代谢过程。局限性：局限性：(1)(1)细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副 产物。产物。(2)(2)细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制 作用。作用。第八页，共八十六页。3.3.固定化原生质体固定化原生质体 意义意义：(1)(1)固定化原生质体去除了细胞壁的扩散障
5、碍，固定化原生质体去除了细胞壁的扩散障碍，有利于氧的传递，营养成分的吸收和胞内产物有利于氧的传递，营养成分的吸收和胞内产物的分泌。的分泌。(2)(2)原生质体不稳定，容易破裂原生质体不稳定，容易破裂(pli)(pli)，固定化后，固定化后，由于载体的保护作用，稳定性提高由于载体的保护作用，稳定性提高。第九页，共八十六页。二、固定化方法二、固定化方法(fngf)(fngf)固定化方法固定化方法(fngf)（一）酶的固定化方法（一）酶的固定化方法(fngf)吸附法吸附法共价偶联法共价偶联法交联法交联法包埋法包埋法网格型网格型微囊型微囊型离子交离子交换吸附换吸附物理物理吸附法吸附法第十页，共八十六页
6、。依据依据(yj)(yj)带电的酶或细胞和载体之间的静电作带电的酶或细胞和载体之间的静电作用，使酶吸附于惰性固体的表面或离子交换剂上。用，使酶吸附于惰性固体的表面或离子交换剂上。1.1.吸附吸附(xf)(xf)法（法（adsorptionadsorption）第十一页，共八十六页。根据吸附剂的特点根据吸附剂的特点(tdin)(tdin)分分:1 1）物理吸附法（）物理吸附法（physical adsortionphysical adsortion）作用力：作用力：氢键、疏水键氢键、疏水键常用载体：常用载体：氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石
7、、纤维素等。硅胶、羟基磷灰石、纤维素等。2 2）离子结合法（）离子结合法（ion bindingion binding）作用力：作用力：离子键离子键常用载体：常用载体：DEAE-DEAE-纤维素、纤维素、DEAE-DEAE-葡聚糖凝胶、葡聚糖凝胶、CM-CM-纤维素纤维素第十二页，共八十六页。优点：优点：条件温和，操作简条件温和，操作简便，酶活力损失便，酶活力损失(snsh)(snsh)少。少。缺点：缺点：结合力弱，易解吸结合力弱，易解吸附附。第十三页，共八十六页。借助共价借助共价键将酶的活性键将酶的活性非必需侧链基非必需侧链基团和载体团和载体(zit)(zit)的功能基团进的功能基团进行偶联
8、。行偶联。2.2.共价共价(nn ji)ji)偶联法（偶联法（covalent covalent binding or covalent couplingbinding or covalent coupling）第十四页，共八十六页。1 1）载体：亲水载体优于疏水载体）载体：亲水载体优于疏水载体如如:天然高分子衍生物天然高分子衍生物:纤维素纤维素 葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶 亲和性好，机械性能差亲和性好，机械性能差 琼脂糖琼脂糖 合成合成(hchng)(hchng)聚合物：聚合物：聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 聚苯乙烯聚苯乙烯 机械性能好，但有疏水结构机械性能好，但有疏水结构 尼龙尼龙第十五页，共八十六页。
9、2 2）偶联方法：）偶联方法：偶联成功偶联成功(chnggng)(chnggng)与否取决于：与否取决于：载体：载体：功能基团：芳香氨基，羧基，羧甲功能基团：芳香氨基，羧基，羧甲基等。基等。酶分子酶分子:侧链非必需基团：羧基，巯基，侧链非必需基团：羧基，巯基，羟基，酚基，咪唑基。羟基，酚基，咪唑基。第十六页，共八十六页。常用常用(chn(chn yn yn)的偶联反应有：重氮化的偶联反应有：重氮化法、叠氮法、溴化氰法、烷基化法等。法、叠氮法、溴化氰法、烷基化法等。第十七页，共八十六页。优点：优点：酶与载体结合牢固，不会轻易脱酶与载体结合牢固，不会轻易脱落落(tulu)(tulu)，可连续使用。
10、，可连续使用。缺点：缺点：反应条件较激烈，易影响酶的空反应条件较激烈，易影响酶的空间构象而影响酶的催化活性。间构象而影响酶的催化活性。第十八页，共八十六页。3.3.交联法（交联法（crosslinkingcrosslinking）借助双功能借助双功能(gngnng)(gngnng)试剂使酶分子之间发试剂使酶分子之间发生交联的固定化方法。生交联的固定化方法。双功能试剂：双功能试剂：常用的是戊二醛常用的是戊二醛 O OH C CH2 CH2 CH2 C H第十九页，共八十六页。戊二醛有两个戊二醛有两个(lin(lin )醛基，均可醛基，均可与酶或蛋白质的游与酶或蛋白质的游离氨基反应离氨基反应,使酶
11、蛋使酶蛋白交联。白交联。此法与共价偶联法利用的均是共价键，此法与共价偶联法利用的均是共价键，不同之处：不同之处：交联法不使用交联法不使用(shyng)(shyng)载体。载体。第二十页，共八十六页。第二十一页，共八十六页。交联反应既能发生在分子间，也可发生交联反应既能发生在分子间，也可发生在分子内。在分子内。酶酶浓浓度度(nngd)低低时时，交交联联发发生生在在分分子子内内，酶酶仍保持溶解状态。仍保持溶解状态。酶酶浓浓度度高高时时，交交联联发发生生在在分分子子间间，酶酶变变为为不不溶溶态。态。第二十二页，共八十六页。缺点：缺点：(1)(1)反应反应(fnyng)(fnyng)条件激烈，酶分子的
12、多个基条件激烈，酶分子的多个基团被交联，酶活力损失大。团被交联，酶活力损失大。(2)(2)制备的固定化酶颗粒较小，给使用带制备的固定化酶颗粒较小，给使用带来不便。来不便。第二十三页，共八十六页。4.4.包埋法（包埋法（entrapmententrapment）将酶用物理的方法包埋将酶用物理的方法包埋在各种载体（高聚物）内。在各种载体（高聚物）内。分为分为(fn wi)：网格型：网格型：将酶包埋在高分将酶包埋在高分子凝胶细微网格中。子凝胶细微网格中。微囊型：微囊型：将酶包埋在高分将酶包埋在高分子半透膜中。子半透膜中。第二十四页，共八十六页。1）网格网格(wn(wn )型包埋法型包埋法（gel(l
13、attic)entrapmentgel(lattic)entrapment）又称凝胶包埋法又称凝胶包埋法凝胶凝胶包埋条件包埋条件酶活性酶活性强度强度天然凝胶天然凝胶琼脂、海藻酸钙、琼脂、海藻酸钙、角叉菜胶、明胶角叉菜胶、明胶温和温和不变不变差差合成凝胶合成凝胶聚丙烯酰胺、光聚丙烯酰胺、光交联树脂交联树脂聚合反应聚合反应部分失活部分失活 高高使用使用(shyng)的多孔载体及其特的多孔载体及其特点点第二十五页，共八十六页。海藻海藻(hi zo)酸钙凝胶包埋法：酸钙凝胶包埋法：滴至滴至海藻酸钠溶液海藻酸钠溶液E(or cell)CaCl2 溶液中溶液中 IE(or IC)角叉菜胶包埋法：角叉菜胶包
14、埋法：滴至滴至角叉菜胶角叉菜胶E(or cell)KCl 溶液中溶液中 IE(or IC)聚丙烯酰胺凝胶包埋法：聚丙烯酰胺凝胶包埋法：APAcr+Bis+E(or cell)IE(or IC)TEMED第二十六页，共八十六页。2 2）微囊型包埋法）微囊型包埋法（microencapsulationmicroencapsulation）又称半透膜包埋法又称半透膜包埋法 将一定量酶液包在半透性的高分子微孔将一定量酶液包在半透性的高分子微孔(wi kn(wi kn)膜内膜内 。半透膜：直径几十微米到几。半透膜：直径几十微米到几百微米，厚约百微米，厚约25nm25nm。半透膜孔径半透膜孔径 80%80
15、%活性。活性。第四十五页，共八十六页。（三）酶的最适温度三）酶的最适温度 最适温度与酶稳定性有关。最适温度与酶稳定性有关。多多数数酶酶固固定定化化后后热热稳稳定定性性上上升升，最最适适温温度度也上升（有例外）。也上升（有例外）。（四）酶的最适（四）酶的最适pHpH 带负电荷载体带负电荷载体 ：最适：最适pH pH 向碱性偏移向碱性偏移(pin y)(pin y)。带正电荷载体带正电荷载体 ：最适：最适pH pH 向酸性偏移。向酸性偏移。第四十六页，共八十六页。第四十七页，共八十六页。固定化酶的表观米氏常数固定化酶的表观米氏常数K Km m随载体的带电性能随载体的带电性能变化。变化。固定化载体与
16、底物电荷相反固定化载体与底物电荷相反,固定化酶的表观固定化酶的表观K Km m值降低。值降低。固定化载体与底物电荷相同固定化载体与底物电荷相同(xin(xin tn tn),固定化酶固定化酶的表观的表观K Km m值显著增加。值显著增加。（五）酶的动力学特征（五）酶的动力学特征(tzhng)(tzhng)第四十八页，共八十六页。与自然酶基本相同。但大分子底物难与自然酶基本相同。但大分子底物难于接近酶分子，导致于接近酶分子，导致(dozh)(dozh)酶的专一性发生酶的专一性发生改变。改变。（六）酶的作用（六）酶的作用(zuyng)(zuyng)专一性专一性 第四十九页，共八十六页。与固定化酶相比与固定化酶相比(xin(xin b)b)，固定化细胞，固定化细胞的情况比较复杂。的情况比较复杂。（1 1）有活性升高的现象。）有活性升高的现象。（2 2）稳定性的增加）稳定性的增加 。（3 3）最适温度和最适）最适温度和最适pHpH常保持不变。常保持不变。二、固定化细胞二、固定化细胞(xbo)(xbo)的性质的性质 第五十页，共八十六页。(一一)酶酶(细胞细胞)的活力的活力 固定化酶通常呈颗粒状
