1、15.1细胞(xbo)的衰老vHayflick limitation 1961 1961年，年，Hayflick Hayflick 首次报道了体外培养的人成纤维细胞首次报道了体外培养的人成纤维细胞(human fibroblast)(human fibroblast)具有增殖分裂的极限。他利用具有增殖分裂的极限。他利用(lyng)(lyng)来自胚来自胚胎和成体的成纤维细胞进行体外培养，发现胚胎的成纤维细胞胎和成体的成纤维细胞进行体外培养，发现胚胎的成纤维细胞分裂传代分裂传代5050次后开始衰退和死亡，而来自成年组织的成纤维细次后开始衰退和死亡，而来自成年组织的成纤维细胞只能培养胞只能培养15
2、153030代就开始死亡。代就开始死亡。v第一页，共四十四页。1v体外培养人的成纤维细胞，在体外分裂次数有限，证明细胞不是不死的v将老年的人的成纤维细胞与年轻的人的成纤维细胞同时培养，年轻状态的细胞在体外分裂次数更多，说明衰老与供体细胞的年纪有关v老年的人的成纤维细胞与年轻的人的成纤维细胞进行混合和单独培养比较实验，发现二者的分裂次数没有变化，说明与培养的环境无关v利用细胞杂交的方法确定引起衰老的真正原因。年轻的胞质体与年老的完整(wnzhng)细胞融合，杂种细胞不能分裂；年老的胞质体与年轻的完整(wnzhng)细胞融合，杂种细胞分裂能力与年轻相同，证明细胞核是导致衰老的真正原因第二页，共四十
3、四页。2人类人类人类人类(rnli)(rnli)成纤维细胞离体培养成纤维细胞离体培养成纤维细胞离体培养成纤维细胞离体培养早期早期(zoq)后期后期(huq)第三页，共四十四页。3早老症儿童早老症儿童(r tng)(r tng)与正常儿童与正常儿童(r tng)(r tng)的比较的比较第四页，共四十四页。415.1.1 15.1.1 衰老细胞衰老细胞(xbo)(xbo)的特征的特征 第五页，共四十四页。5细胞(xbo)衰老的分子机理（一）差错学派1、代谢废物积累：如：脂褐质2、自由基攻击：导致DNA、蛋白质变异，正常细胞内存在清除自由基的防御(fngy)系统：酶系统：超氧化物歧化酶(SOD)，
4、过氧化氢酶(CAT)，谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)；非酶系统：维生素E，醌类等电子受体。第六页，共四十四页。6遗传(ychun)论学派1、细胞有限分裂学说“Hayflick”极限，即细胞最大分裂次数。L.Hayflick(1961)报道，人的成纤维细胞在体外培养时增殖(zngzh)次数是有限的（6070代）。细胞增殖次数与端粒DNA长度有关。2、重复基因失活学说：如哺乳动物rRNA基因数随年龄而减少。第七页，共四十四页。73、衰老基因学说子女的寿命与双亲的寿命有关；各种动物都有相当恒定(hngdng)的平均寿命和最高寿命；成人早衰症：平均39岁时出现衰老，47岁生命结束；婴幼儿早衰症：1
5、岁时出现明显的衰老，1518岁生命结束，早衰症患者体内解旋酶发生突变。Caenrhabditis elegans的平均寿命仅3.5天，该虫age-1单基因突变，可提高平均寿命65%，提高最大寿命110%。第八页，共四十四页。8自由基攻击细胞自由基攻击细胞(xbo)(xbo)的证的证据据第九页，共四十四页。915.2程序性死亡(swng)PCD(programcelldeath)第十页，共四十四页。10第十一页，共四十四页。11死亡(swng)坏死坏死(huis)(huis)凋亡凋亡(dio wn(dio wn)15.2.1简介细胞坏死：是细胞受到急性强力伤害时立即出现的反应。早期表现为细胞膜破
6、坏，线粒体肿胀 继而溶酶体破裂,细胞内容物流出,引起炎症。第十二页，共四十四页。12v2002年诺贝尔生理学或医学奖v英国科学家悉尼(xn)布伦纳（SydneyBrenner）v英国科学家约翰苏尔斯顿（JohnE.Sulston）v美国科学家罗伯特霍维茨（H.RobertHorvitz）第十三页，共四十四页。1320022002年年的的诺诺贝贝尔尔生生理理学学和和医医学学奖奖授授予予了了在在器器官官发发育育和和程程序序性性细胞死亡研究领域中做出奠基性贡献的细胞死亡研究领域中做出奠基性贡献的3 3位科学家位科学家:英国的英国的BrennerBrenner、SulstonSulston和美国的和美
7、国的HorvitzHorvitz他他们们创创造造性性地地用用线线虫虫作作为为实实验验模模型型,实实现现了了对对器器官官发发育育过过程中细胞分裂、分化的原位观察程中细胞分裂、分化的原位观察,完成了细胞图谱的绘制完成了细胞图谱的绘制,在在此此基基础础上上发发现现并并研研究究了了调调控控器器官官发发育育程程序序性性细细胞胞死死亡亡的的关关键键基基因因及及其其功功能能并并进进一一步步在在高高等等(godng)(godng)哺哺乳乳动动物物中中发发现现了了相关功能基因。相关功能基因。第十四页，共四十四页。14Kerr（1972）最先提出，与细胞坏死的区别是：细胞通过出芽的方式形成许多凋亡小体；凋亡小体内
8、有结构完整的细胞器；不引起炎症；线粒体无明显形态(xngti)变化，溶酶体活性不增加；内切酶活化，DNA有控降解，凝胶电泳图谱呈梯状；凋亡通常是生理性变化，而细胞坏死是病理性变化。第十五页，共四十四页。1515.2.2坏死(huis)与凋亡第十六页，共四十四页。16 PCD 第十七页，共四十四页。17坏死坏死(hui s)凋亡凋亡(dio wn)第十八页，共四十四页。18D DN NA A L LA AD DD DE ER R 180200bp转谷氨酰胺酶tTG（tissueTransglutaminase）增加(zngji)(zngji)生化生化(shn hu)特征特征第十九页，共四十四页。
9、19细胞凋亡(diown)和细胞坏死的区别区别点细胞凋亡细胞坏死起因生理或病理性病理性变化或剧烈损伤范围单个散在细胞大片组织或成群细胞细胞膜保持完整，一直到形成凋亡小体破损染色质凝聚在核膜下呈半月状呈絮状细胞器无明显变化肿胀、内质网崩解细胞体积固缩变小肿胀变大凋亡小体有，被邻近细胞或巨噬细胞吞噬无，细胞自溶，残余碎片被巨噬细胞吞噬基因组DNA有控降解，电泳图谱呈梯状随机降解，电泳图谱呈涂抹状蛋白质合成有无调节过程受基因调控被动进行炎症反应无，不释放细胞内容物有，释放内容物。第二十页，共四十四页。20PCD PCD 调控调控(dio kn)(dio kn)神经细胞的数量神经细胞的数量 第二十一页
10、，共四十四页。211.1.形态学形态学第二十二页，共四十四页。222.电泳电泳(din yn)方法方法彗星(huxng)电泳第二十三页，共四十四页。233.DNA TUNEL3.DNA TUNEL第二十四页，共四十四页。24第二十五页，共四十四页。254.CaspaseactivityWesternblot第二十六页，共四十四页。26第二十七页，共四十四页。275.流式细胞仪分析流式细胞仪分析(fnx)(fnx)第二十八页，共四十四页。2815.2.4揭开凋亡(diown)的机制第二十九页，共四十四页。29第三十页，共四十四页。3015.2.4.1CED3/CASPASESvCaspases:
11、(cysteine asparic acic specific protease)vCaspases 高度选择高度选择(xunz)切割蛋白质，发生在少数结构域区域，活化切割蛋白质，发生在少数结构域区域，活化或者失活但不降解蛋白质或者失活但不降解蛋白质第三十一页，共四十四页。31Caspasesn Caspases2，8，9，10；take part in start PCDn Caspases3，6，7；takepartinperformPCDn Caspases1，4，15；indirect function 第三十二页，共四十四页。32Caspases在哺乳动物(brdngw)中的调控第三
12、十三页，共四十四页。33PCD gene in C.elegans C.elegans:Ced3Ced4Ced9Human：ICE,apopain(死亡(swng)酶）,Apaf1Bcl2第三十四页，共四十四页。34A 受体介导的程序性细胞受体介导的程序性细胞(xbo)死亡途径死亡途径第三十五页，共四十四页。35NATUREREVIEWS|CANCER VOLUME2|APRIL2002|277Deathinducingsignalingcomplex第三十六页，共四十四页。36Fas与配体（如TNF）结合发生三聚化，使胞内的DD 区（Death domain）与接头蛋白FADD的DD区结合。
13、FADD N 端通过DED 区（death effector domain）与Caspase-8前体结合，Caspase-8通过自剪接激活(j hu)。Caspase-8引起caspase级联反应，激活Caspase-3、6、7。Caspase可降解结构蛋白、信号蛋白、转录调控蛋白、周期蛋白等等。第三十七页，共四十四页。37胞外信号分子诱导的细胞凋亡(dio wn)途径小结凋亡信号通路凋亡信号通路 当细胞接受凋亡信号分子当细胞接受凋亡信号分子(Fas,TNF(Fas,TNF等等)后，凋亡后，凋亡细胞表面信号分子受体相互聚集并与细胞内的衔接蛋细胞表面信号分子受体相互聚集并与细胞内的衔接蛋白白(A
14、daptor protein)(Adaptor protein)结合，这些衔接蛋白又募集结合，这些衔接蛋白又募集ProcaspasesProcaspases聚集在受体部位，聚集在受体部位，ProcaspaseProcaspase相互活化相互活化并产生级联反应，下游并产生级联反应，下游CaspasesCaspases活化后使细胞凋亡。活化后使细胞凋亡。l l 裂解核纤层蛋白，导致细胞核形成凋亡小体；裂解核纤层蛋白，导致细胞核形成凋亡小体；l l 裂解裂解DNaseDNase结合蛋白，使结合蛋白，使DNaseDNase释放，降解释放，降解DNADNA形成形成DNA Ladder;DNA Ladde
15、r;l l 裂解参与细胞连接或附着的骨架和其他裂解参与细胞连接或附着的骨架和其他(qt)(qt)蛋白，使凋蛋白，使凋亡细胞皱缩、亡细胞皱缩、l l 脱落，便于细胞吞噬；致膜脂脱落，便于细胞吞噬；致膜脂PSPS重排，便于吞噬重排，便于吞噬细胞识别并吞噬。细胞识别并吞噬。第三十八页，共四十四页。3815.2.4.2CED4/Apaf1v影响细胞凋亡蛋白质活性的因子vApaf2就是(jish)细胞酶色素C第三十九页，共四十四页。39细细胞胞(x x b b o o)内内源源信信号号激激发发细细胞胞(x x b b o o)程程序序性性死死亡亡Apoptosis protease activating
16、 factors Apaf2 C.elegans 第四十页，共四十四页。4015.2.4.3Bcl-2家族(jiz)与细胞凋亡Bcl-2是一种原癌基因，是ced-9在哺乳类中的同源物，能抑制细胞凋亡；与线粒体及内质网膜相结合；Bcl-2蛋白的羧基末端有一穿膜的结构域；Bcl-2家族成员的基因中，常常含有三个保守的Bcl-2同源区，即BH1，BH2和BH3 Bcl-2Bcl-2基基因因蛋蛋白白表表达达可可抑抑制制多多种种组组织织细细胞胞的的凋凋亡亡，Bcl-2Bcl-2蛋蛋白白是是线线粒粒体体膜膜关关联联的的稳稳定定蛋蛋白白，它它主主要要位位于于线线粒粒体体外外膜膜、核核被被膜膜和和内内质质网网膜膜。高高浓浓度度Bcl-2Bcl-2蛋蛋白白抑抑制制内内质质网网中中钙钙离离子的释放子的释放哺乳动物(brdngw)细胞中发现的Apaf2即是CytC Bcl-2、线粒体与细胞凋亡第四十一页，共四十四页。41 Bcl-2对线粒体功能的调控对线粒体功能的调控v抑制凋亡蛋白抑制凋亡蛋白(dnbi)：Bcl-2、Bcl-XL、Mc15、Bfe1、A1。v促凋亡蛋白：促凋亡蛋白：Bax、Bcl-XS、B
