1、GB/T18932.9-2002蜂蜜中青霉素残留量的测定方法杯碟法1范围GB/T18932的本部分规定了蜂蜜中青霉素残留量的杯碟测定方法。本部分适用于各种蜂蜜中青霉素残留量的测定。本部分青霉素的方法检出限为0.025mg/kg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过GB/T18932的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。GB/T6379-1986测试方法的精密度通过实验室间试验确定标准测试方法的重复性
2、和再现性(neq ISO 5725:1981)GB/T6682-1992分析实验室用水规格和试验方法(neq ISO 3696:1987)3原理试样中残留的青霉素经用磷酸盐缓冲液溶解、离心后，取上清液作杯碟法测定，并用标准曲线进行定量。青霉素酶作确证试验。4试剂和材料除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682-1992中规定的三级水。4.1试验菌种藤黄微球菌(Micrococcus Luteus)。菌种号(China Microbial Culture Collection)CMCC(B)28001,4.2标准物质青霉素钠。1663IU/mg或相当者。4.3青霉素酶(-内酰胺酶)4
3、.4工作溶液的配制4.4.1磷酸盐缓冲溶液：pH6.0。称取8.0g无水磷酸二氢钾，2.0g无水磷酸氢二钾，溶解于水中并定容至1000mL。4.4.2生理盐水：8.5g/L。称取8.5g氯化钠，溶解于1000mL水中，121高压灭菌20min。4.5标准溶液的配制4.5.1青霉素标准储备溶液：准确称取（精确至0.1mg)青霉素标准物质(4.2），用磷酸盐缓冲溶液(4.4.1)溶解并定容为1000 ug/mL(按效价换算)的标准储备溶液。当天配制，当天使用。4.5.2青霉素标准工作溶液：取标准储备溶液(4.5.1)用磷酸盐缓冲溶液稀释，配制浓度为0.20、0.100.05、0.025和0.012
4、5g/mL的标准工作溶液。当天配制，当天使用。GB/T18932.9-2002工作溶液将得出36个抑菌圈直径读数的数据，其他浓度标准工作溶液将各得九个抑菌圈直径读数的数据。盖好陶瓦盖，置(351)C培养18h1h后取出，翻转平板，除去牛津杯，执游标卡尺准确地测量各抑菌圈直径（精确到0.1mm),求出各组平板中标准工作溶液浓度及参考浓度(0.05g/mL),抑菌圈直径读数的平均值以及参考浓度(0.05g/mL),36个抑菌圈直径读数的总平均值。用参考浓度(0.05g/mL)的总平均值减去各组参考浓度(0.05g/mL)的平均值之差为校正值，以此值校正其他各浓度标准工作溶液及被测样品溶液抑菌圈直径
5、读数的平均值。将各组校正值代入式(1)和式(2)中，求出L和H值，在半对数坐标上，以抑菌圈直径(mm)为纵坐标（算术级），以标准工作溶液浓度（g/mL)为横坐标（对数级），标出L和H点，连一直线，即为标准曲线。L=(3a+2b+c-e)/5(1)H=(3e+2d+c-a)/5(2)式中：L标准曲线上最低浓度(0.0125 g/mL)的抑菌圈直径，单位为毫米(mm);H标准曲线上最高浓度(0.20 g/mL)的抑菌圈直径，单位为毫米(mm);c参考浓度(0.05 g/mL)抑菌圈直径的总平均值，单位为毫米(mm);a、b、d、e分别表示标准曲线中其他各浓度标准工作溶液(0.0125、0.025、
6、0.10、0.20ug/mL)抑菌圈直径数据的校正值，单位为毫米(mm)。7.2.4样品溶液的测定每份样品溶液需三个检定用平板(7.2.2)。按7.2.3标准曲线制备的要求放置牛津杯，各平板中的三个牛津杯中注满参考浓度(0.05g/mL)标准工作溶液，另三个牛津杯中则注满被测样品溶液。将陶瓦盖盖好，(351)C培养18h1h后，翻转平板，除去牛津杯，执游标卡尺准确地测量抑菌圈直径（精确到0.1mm),分别求出被测样品溶液及参考浓度抑菌圈直径读数的平均值。7.3确证试验如被测样品溶液抑圈菌直径读数的平均值10mm时，应做确证试验。取青霉素酶(4.3)并按产品说明稀释。将此稀释溶液按比例加到样品溶
7、液中(1+19)，(351)C培养30min。取三个检定用平板，按7.2.3标准曲线制备的要求放置牛津杯。各平板中的两个牛津杯中注满参考浓度(0.05g/mL)标准工作溶液，另两个牛津杯中注满未加酶处理的样品溶液，最后两个牛津杯中则注满经酶处理的样品溶液。将陶瓦盖盖好，(351)C培养18h1h后，如经酶处理过的样品溶液无抑菌圈形成，而未经酶处理的样品溶液仍有抑菌圈形成，说明样品溶液中的抑菌物质确为青霉素。本方法的添加回收率数据参见附录B。8结果计算如被测样品溶液抑菌圈直径读数的平均值10mm,即报告为“未检出”。如被测样品溶液抑菌圈直径读数的平均值10mm,按7.2.3要求校正后，从标准曲线上查出相应的青霉素含量（g/mL),再乘以样品的稀释系数2，即得出以g/mL计的青霉素含量，根据确证试验(7.3)报告结果。如果样品中青霉素的含量单位用mg/kg表示时，可将g/mL按式(3)进行换算。X=C.(3)式中：X样品溶液中青霉素的含量，单位为毫克每千克(mg/kg);3
