1、ICS11.220B41B中华人民共和国国家标准GB/T27637-2011副结核分枝杆菌实时荧光PCR检测方法Real-time PCR method for the detection ofMycobacterium avium subsp.paratuberculosis2011-12-30发布2012-04-01实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会发布GB/T2763720115.1.2无菌注射器或真空采血管。5.1.3灭菌容器。5.1.4橡胶管。5.1.5刮匙。5.1.6荧光PCR仪。5.1.7恒温水浴锅（室温至100）。5.1.8离心机（最高离心力达1
2、5000g以上）。5.1.9混匀器。5.1.10冰箱(28，-20，-80)。5.1.11天平（精密度达千分之一以上）。5.1.12微量可调移液器(10L,100L,1000L)。5.1.13微量带滤芯吸嘴(10L,100L,1000L)。5.1.14研钵。5.1.15离心管。5.1.16PCR光学反应管。5.2试剂5.2.1试剂级别：除另有规定，本方法试验用水应符合GB/T6682一2008规定的二级水，所用化学试剂均为分析纯。5.2.2引物与探针：采用无DNA酶、无RNA酶水将每条引物与探针配制成100mol/几储存液，置一20或更低温度冻存；使用时取适量配制成10mol/几工作液，避免多
3、次冻融。上游引物：5GTCAGCGGCGGTCCAG3,下游引物：5GCAGCTCCAGATCGTCATTC3,探针：5-FAMACGAGCACGCAGGCATTCCAAGTC 3-BHQ-1.5.2.30.01mol/LpH7.6PBS:配方见A.1。5.2.4柠檬酸钠缓冲液：配方见A.2。5.2.50.5mol/L EDTA:配方见A.3,5.2.6柠檬酸钠-磷酸缓冲液：配方见A.4。5.2.74%氢氧化钠溶液：配方见A.5。5.2.84%硫酸溶液：配方见A.6。5.2.9 Triton X-100.5.2.10DNA提取液：含100mmol/L Tris-HCl(pH8.0),0.01%Triton X-100,200g/L蛋白酶K。也可采用等效商品化试剂。5.2.11灭菌双蒸水，5.2.12三氯甲烷。5.2.13异丙醇。5.2.14无水乙醇。5.2.1570%乙醇：用新开启的灭菌双蒸水配制，一20预冷。5.2.16荧光PCR反应缓冲液：含50mmol/LKCl,10mmol/L Tris-.HCl(pH8.3),2.5mmol/LMgC12,5%二甲基亚砜(DMSO),5%甘油。可采用等效商品化试剂。5.2.17dNTP:dATP、dUTP、dCTP和dGTP,5.2.18Tq酶。5.2.19UDG前。2
