1、宁夏医科大学学报45卷收稿日期：2022-08-30基金项目：国家自然科学基金项目（81960584）作者简介：孙祎平（1993），男，在读硕士研究生，研究方向：环境有害因素的健康效应研究。通信作者：杨惠芳，女，教授，博士研究生导师，研究方向：环境有害因素的健康效应研究。E-mail：农药的广泛使用可以提高农作物的产量，但在环境中的农药残留会对人和动物的身体健康造成很大的影响。拟除虫菊酯因具有高效、易降解、低毒等特点，在全球范围内都有着广泛的应用1。课题组前期研究2发现，在银川市近郊蔬菜大棚内农药残留中，氟氯氰菊酯的残留量最多。氟氯氰菊酯作为重要的型拟除虫菊酯类农药，广泛应用于卫生害虫防治3。
2、有研究4显示，拟除虫菊酯可引起肾脏形态结构异常改变、肾功能障碍，而氟氯氰菊酯对肾脏的毒性机制尚不清楚。生长停滞和 DNA 损伤诱导 （growth arrest andDNA damage-inducible 45，GADD45B）是一种应激蛋白，与细胞周期停滞、细胞凋亡和致癌应激的反应等密切相关5。抑制 GADD45B 可以防止蛋白尿以及减轻足细胞的损伤，从而保护肾小球6。在肾脏损伤过程中，MAPK 作为一条关键的信号通路，其中的关键因子 p38 丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK）、c-Jun 氨基末端激酶（c-Ju
3、n N-terminal kinase，JNK）明显上调7。GADD45B 介导 JNK/p38MAPK通路在氟氯氰菊酯所致大鼠肾脏损伤中的关系尚不明确，因此，本研究旨在探讨在氟氯氰菊酯诱导大鼠肾脏损伤中 MAPK 通路的作用，为进一步阐明毒性机制，建立早期预防策略提供理论依据和方法。1资料与方法1.1实验动物选择 40 只 Wistar 雄性大鼠，SPF 级，体质量260280 g，购自辽宁昌盛生物技术有限公司 动物合格证号：SCXK（Liao）2015-0001。所有大鼠氟氯氰菊酯通过 GADD45B 介导 JNK/p38MAPK通路对大鼠肾脏损伤的影响孙祎平1，2，李晓玉1，2，谢永鑫1
4、，2，赵吉1，2，孙健1，2，王瑞1，2，宋亚男1，2，杨惠芳1，2（1.宁夏医科大学公共卫生与管理学院，银川750004；2.宁夏环境因素与慢性病控制重点实验室，银川750004）摘要：目的探讨氟氯氰菊酯暴露通过影响生长停滞和 DNA 损伤诱导 （GADD45B）水平并介导 JNK/p38MAPK 通路对大鼠肾脏损伤的影响。方法将 40 只 SPF 级 Wistar 雄性大鼠按随机数表法分为 4 组，即对照组、氟氯氰菊酯低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组 10 只。隔天灌胃连续染毒 28 d，取肾脏组织称量后计算脏器系数。HE 染色光镜下观察大鼠肾脏组织病理形态变化；透射电镜观察肾脏细胞超微
5、结构变化；应用试剂盒检测肾脏组织中氧化损伤指标超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）含量变化；应用 Western blot、qPCR检测 GADD45B、p38MAPK、p-p38MAPK、JNK、p-JNK mRNA 及蛋白表达水平变化。结果与对照组相比，氟氯氰菊酯染毒大鼠体质量增长、肾脏质量和脏器系数的差异均无统计学意义（P 均0.05）；HE 染色结果显示：与对照组相比，随着氟氯氰菊酯染毒剂量的增加，肾小管肿胀越发明显，肾小管上皮细胞大量脱落，肾小球萎缩。透射电镜结果显示：与对照组相比，随着氟氯氰菊酯染毒剂量的增加，基底膜逐渐增厚，线粒体和内质网出现不同程度损伤。与对照组比较，低、
6、中、高剂量组 MDA 含量均升高（P 均0.05）、SOD 活力均降低（P 均0.05）。与对照组相比，氟氯氰菊酯低、中、高剂量组中 GADD45B 的 mRNA 表达水平均升高（P 均0.05）；JNK和 p38MAPK 的 mRNA 表达水平均降低（P 均0.05）。Western blot 结果显示，与对照组比较，氟氯氰菊酯低、中、高剂量组中 GADD45B、p-JNK、p-p38 的蛋白表达水平均升高（P 均0.05）；JNK 和 p38 的蛋白表达水平均降低（P 均0.05）。结论在氟氯氰菊酯致大鼠肾脏损伤中，GADD45B 可通过激活 JNK/p38MAPK 通路诱导大鼠肾脏损伤。
7、关键词：GADD45B；氟氯氰菊酯；肾脏；JNK/p38MAPK 通路中图分类号：R114文献标识码：ADOI：10.16050/ki.issn1674-6309.2023.03.003文章编号：1674-6309（2023）03-0230-06论著第 45 卷3 期2023 年 3 月宁夏医科大学学报Journal of Ningxia Medical University2303期基因名称方向序列GADD45BForwardReverseJNK1ForwardReverseJNK2JNK3ForwardReversep38MAPKForwardReverseTGCCTCCTGGTCACGA
8、ACTGTCCCACTGGTTATTGCCTCTGCTCTCTGACAGGACAGGACGAGCAGTAGTGTGTGGGTGTGTGGCAGAAACCAGTCGTGTGGTGTCCTTGGTGTGGGCAAGTTCAAGCAAGCATTTGACGCCAACTTGTGTCAGGTGATTCCAGCGGAGTGGAGGTGTTTGATGACAGTCCTCTCCTCTCCTCTCCTCTCGGTTCTCCCTTTGTTCGGTTTGForwardReverse饲养于标准动物房，饲料喂养，自由饮水，饲养环境温度（222），相对湿度 60%70%，保持 12 h光照（8：3020：30）和 12 h
9、黑暗（20：30 至次日8：30）交替循环。大鼠适应性喂养 1 周后，设置对照组（玉米油），氟氯氰菊酯低剂量组（6.25 mg kg-1）、中剂量组（12.50 mg kg-1）和剂量组（25.00 mg kg-1），每组 10 只。对大鼠进行隔天称重，根据前一天称取的体质量配制染毒药物。采用等浓度法进行灌胃染毒，对照组大鼠灌胃等量玉米油，隔天染毒，持续 28 d，随后麻醉处死大鼠，在无菌条件下收集肾脏组织，各动物处理方法均严格遵守中华人民共和国实验动物操作的相关规定，本研究项目获得宁夏医科大学伦理委员会（IACUC-NYLAC-2021-101）批准。1.2主要试剂与仪器氟氯氰菊酯（德国 D
10、r.Ehrenstorfer 公司）；丙二醛（malondialde hyde，MDA）试剂盒（北京索莱宝公司）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒（南京建成生物工程研究所）；BCA蛋白检测试剂盒（江苏凯基公司）；全蛋白提取试剂盒、SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒（上海碧云天公司）；GAPDH、GADD45B、p-p38MAPK、p-JNK、p38MAPK、JNK 抗体（中国 Affinity 公司）。蛋白Marker（美国 Thermo Fisher 公司）；Trizol（美国 Invitrogen 公司）；引物由上海生工公司合成。1.3观察指标1.3.
11、1HE 染色取出切割好的肾脏组织和对应的标签放入脱水箱，分别在 75%、85%、90%和95%的乙醇梯度中脱水 1 h，在无水乙醇和无水乙醇中分别脱水 30 min，接着放置于二甲苯和二甲苯中分别脱水 5 min。经过包埋、切片、染色，用显微镜（40）观察肾脏组织的形态结构变化。1.3.2透射电镜取 3 mm1 mm1 mm 的新鲜肾脏组织，放入 4 固定液中 24 h，然后放入1%渗透压 0.1 mol L-1磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中固定 2 h。经过 50%70%80%90%95%100%100%乙醇100%丙酮脱水，每次 15 min；环氧树脂包埋样本；超薄切片机切 6080 nm
12、 超薄切片；醋酸铀染色 30 min，待切片室温干燥后，在透射电子显微镜下观察，采集图像分析。1.3.3MDA 检测使用 MDA 试剂盒检测其含量，取 0.1 g 肾脏组织，加入 1 mL 提取液进行冰浴匀浆；8 000g 4 C 离心 10 min，取上清，置冰上待测。根据说明书将样本加入 96 孔板中，测定各样本在 532 nm 和 600 nm 处的吸光度，计算MDA 含量，实验重复 3 次。1.3.4SOD 检测称取 50 mg 组织，加入 0.45 mL生理盐水，剪碎组织，冰水浴制备匀浆，3 000 r min-1，离心 10 min，取 10%匀浆上清液冰上待测。样本准备好后用 B
13、CA 试剂盒测定蛋白浓度。根据说明书将样本加入 96 孔板中，测定各样本在 450 nm处的吸光度。SOD 抑制率（%）=（A对照-A对照空白）-（A测定-A测定空白）/（A对照-A对照空白）100%，SOD活力（U mg prot-1）=SOD 抑制率（%）/50%12/待测样本蛋白浓度（mg prot mL-1），实验重复 3 次。1.3.5qPCR 检测取出肾脏组织放置于冰上，使用 Trizol 法提取总 RNA，逆转录合成 cDNA。引物序列见表 1，扩增条件为：95 预变性 5 min，95 变性 10 s、60 退火 30 s、60 延长 30 s，45 个循环。根据扩增曲线数据，
14、分析扩增曲线后计算 2-Ct，分析相关因子的 mRNA 表达水平，每个样品重复试验 3 次。1.3.6Western blot 检测取 50 mg 肾脏组织，加入 0.5 mL 的组织裂解液进行冰浴匀浆研磨，12 000 r min-1，4 离心 10 min，提取肾脏组织表 1引物序列孙祎平，等.氟氯氰菊酯通过GADD45B介导JNK/p38MAPK通路对大鼠肾脏损伤的影响231宁夏医科大学学报45卷全蛋白，采用 BCA 法测定蛋白浓度，配制 SDS-PAGE 凝胶，80 V 稳定电压电泳后转模，3%BSA封闭 1 h，于 11 000 稀释的一抗中 4 孵育过夜，经 TBST 清洗 3 次
15、，10 min/次，再于 11 000稀释的二抗室温孵育 1 h，用 TBST 清洗 3 次，10 min/次，使用 ECL 发光液于避光条件下进行曝光。应用 Image J 软件计算各条带的灰度值。1.4统计学方法采用 SPSS 21.0 统计学软件进行数据分析，计量资料以均数标准差（xs）表示，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），两两比较采用 Dunnett-t 检验。P0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1氟氯氰菊酯对大鼠体质量的影响经过氟氯氰菊酯染毒，各组大鼠体质量差异无统计学意义，染毒前与染毒 14 d、28 d 相比，差异无统计学意义（P 均0.05），见
16、表 2。表 2氟氯氰菊酯对大鼠体质量的影响（xs，g）组别n染毒前染毒 14 d染毒 28 d对照组10336.2010.18417.0218.16471.2020.16低剂量组10338.907.25421.6518.29472.4019.87中剂量组10336.3014.02422.1017.15433.9043.22高剂量组10347.5011.27419.3016.51425.1027.84F 值1.7530.9412.197P 值0.1710.4270.1282.2氟氯氰菊酯对大鼠肾脏质量及脏器系数的影响经过氟氯氰菊酯染毒各组大鼠肾脏质量和脏器系数差异均无统计学意义（P 均0.05），见表 3。表 3氟氯氰菊酯对大鼠肾脏质量及器官系数的影响组别肾脏质量/g器官系数/%对照组2.700.230.570.04低剂量组2.800.270.610.04中剂量组2.630.230.580.05高剂量组2.600.250.560.05F 值P 值0.6290.3930.6160.7622.3氟氯氰菊酯染毒对大鼠肾脏组织结构的影响2.3.1光镜下 HE 染色病理切片观察大鼠肾脏形态结构变化
