1、论著基础研究 ：在口腔鳞癌中的表达及其对 细胞增殖、迁移和侵袭的影响张华，蒋雅欣，孙凌寒，文才，冯浩（西南医科大学口腔医学院，四川泸州 ；西南医科大学附属口腔医院口腔颌面外科，四川泸州 ；西南医科大学附属口腔医院种植科，四川泸州 ）摘要目的探讨染色质 的 相关基质关联肌动蛋白依赖调节因子（）在口腔鳞癌（）中的表达水平及其对人 细胞系 增殖、迁移和侵袭的影响。方法从高通量基因表达（）数据库中分析 组织中 表达情况，并分析其与 患者预后的关系。慢病毒 沉默 细胞中 的表达，实时荧光定量逆转录 （）验证沉默效果；将细胞分为 组（不做转染处理，空白对照）、组（转染无序列质粒载体慢病毒，阴性对照）和 组
2、（转染沉默 质粒载体慢病毒），实验检测 细胞增殖能力的变化，细胞划痕实验检测 细胞迁移能力的变化，实验检测 细胞迁移和侵袭能力的变化。结果 在 组织中的表达水平明显高于人正常口腔组织（）；高表达的患者总生存率低于低表达的患者（）。组 细胞的增殖、迁移和侵袭能力较 组明显降低（）。结论 在 中表达升高，并可促进人 细胞系 的增殖、迁移和侵袭。关键词口腔鳞状细胞癌；增殖；迁移；侵袭；中图法分类号 文献标识码 文章编号 （），（.，；.，；.，）（）（），（），（）（，），（，）（）（）重庆医学 年月第 卷第期基金项目：四川省泸州市人民政府西南医科大学科技战略合作项目（）；西南医科大学校级科研项目（
3、）。作者简介：张华（），在读硕士研究生，主要从事口腔颌面外科学研究。通信作者，：。（），（），；口腔鳞癌（，）是口腔中最常见的上皮恶性肿瘤，具有侵袭性强、转移率高和易复发的特点。细胞的增殖、迁移与侵袭是导致 预后较差的原因之一，目前影响其发生的机制尚未完全清楚，因此，本研究将探索其相关影响因子，为 的治疗提供可能的新靶点。染色质调控是 修复、复制和转录的一个重要环节，染色质重塑复合物在这一环节中起着重要作用。来自模式生物和哺乳动物的证据表明，染色质信号部分是通过模拟开关（，）依赖三磷酸腺苷（）的染色质重塑复合物实现的。染色质 的 相关基质关联肌动蛋白依赖调节因子（，）又称为人类蔗糖非发酵蛋白同
4、源物（，），该基因位于染色体 ，是具有 酶活性的染色质重塑蛋白 家族的重要成员。有报道指出，在基因转录、修复和 复制中起着至关重 要 的 作 用。近 年 来，有 多 项 研 究 表 明 在乳腺癌、胃癌、急性白血病、卵巢癌、非小细胞肺癌等癌症中异常高表达并能调控癌症的进展。而 在 中的表达情况及对 细胞的影响尚未见确切报道。本研究利用高通量基因表达（，）数据库探索 在 中的表达情况及其与患者预后的相关性，并利用体外实验检测 对 细胞系 增殖、迁移和侵袭的影响。材料与方法 主要实验材料与试剂人 细胞系 购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；培养基、胎牛血清（）购自以色列 公司；胰蛋白酶溶液、双
5、抗、结晶紫染液购自北京索莱宝科技有限公司；干扰 （）和 （阴性对照）序列由元生物技术（上海）股份有限公司合成；快速 提取试剂盒、逆转录 试剂盒、试剂盒购自湖南艾科瑞生物工程有限公司；试剂盒购自日本 公司；小室购自美国 公司；基质胶购自美国 公司；孔板、孔板购自上海科进生物技术有限公司。方法 数据库分析 数据库（：）是一个由美国国立生物技术信息中心（）创建并维护的公共基因表达数据库。本研究利用该数据库分析了 组织中 表达情况，并分析其与 患者预后的相关性。细胞培养及 基因干扰转染与筛选细胞 培 养：用 含 有 及双 抗 的培养基于 和 条件下培养 细胞，细胞汇合长满约 后，胰酶消化细胞并传代培养
6、。将细胞分为组：（）组（空白对照），未经转染处理；（）组（阴性对照），转染无序列质粒载 体 慢 病 毒；（）组，转 染 沉 默 质 粒 载 体 慢 病 毒。取 对 数 生 长 期 的 细胞接种于孔板，约 孔，后加入 及 转染序列慢病毒，同时加入 提高转染效率，孵育 后更换培养基继续培养。后使用荧光显微镜观察荧光表达，确认感染成功后加入 嘌呤霉素处理以筛选稳定转染株。转染序列 ：；：。实时荧光定量逆转录 （）快速 提取试剂盒提取 细胞 ，并使用 逆转录 进行逆转录。按照制造商的说明，使用 试剂盒进行 检测。循环条件：；，个循环；其中甘油醛磷酸脱氢酶（）为内参。引物序列见表。实验将 细胞制成密度
7、的细胞悬液，向 孔板中每孔加入 细胞悬液，即 孔的密度，放入培养箱中培养。将细胞分别培养、后，向孔内加入 检测液，培养箱中孵育。用酶标仪测定各孔 处吸光度（）值。重庆医学 年月第 卷第期表 所需引物基因方向引物序列（）产物大小（）正向 反向 正向 反向 细胞划痕实验将 细胞以 孔的密度接种于孔板中，细胞汇合至单层时，用 枪尖做细胞划痕，用磷酸盐缓冲液（）洗掉划下的细胞及细胞碎片，并重新加入不含 的培养基，放入培养箱中继续培养。于、显微镜下观察划痕区域并采图，使用 软件计算愈合的划痕面积。细胞迁移与侵袭实验（）迁 移 实 验：细 胞 在 无 血 清中 饥 饿，将细胞制成密度为 的细胞悬液，取 小
8、室放于 孔板内，上腔室中加入 细胞悬液（个细胞），将含 的培养基加入下腔室中，孵育 后，多聚甲醛固定液固定 ，用 结晶紫染液染色，显微镜下观察并随机取个视野拍照，计数迁移细胞平均数。（）侵袭实验：用预冷的无血清 培养基稀释 （稀释比例:）。每个上腔室加入 稀释液，放入孵育箱中，直至变为半固态。其余步骤同迁移实验，计数侵袭细胞平均数。统计学处理采用 软件进行统计分析及作图，计量资料采用表示，组间比较采用独立样本检验，多组间比较采用单因素方差分析（），以 为差异有统计学意义。结果 在 组织中高表达对 数据库进行生物信息学分析发现，在 份 组织和 份人正常口腔组织的表达信息中，组织中 表达水平明显高
9、于人正常口腔组织（），在 组织中呈高表达，见图。表达与 患者预后的关系在 数据库中分析 与 患者预后的关系，从 数据库中下载相关数据集，包含 例 患者的预后信息，将 例患者依据 表达水平中位数划分为高表达和低表达两组。结果显示：在 患者中，高表达患者的总生存率明显低于低表达患者（），见图。图 数据库中 组织与人正常口腔组织中 表达水平图 数据库中 表达与 患者预后的关系 转染效率检测荧光显微镜观察结果显示：组细胞无荧光，组、组 有 大 量 荧 光，见 图。为 了 检 测 转 染 效 果，用 检 测 表达，结果显示：与 组比较，组 表达水平无明显变化，组 表达水平明显降低（），见图。因此，后期实
10、验只设 组对照。沉默 使 细胞的增殖能力变化 实 验 结 果 显 示，与 组 比 较，组 值明显降低（），见图。重庆医学 年月第 卷第期：慢病毒 转染 细胞后各组的荧光效果（）；：慢病毒 转染 细胞后 表达水平柱状图；：，与 组比较。图 细胞 转染效率检测：。图 检测 细胞增殖能力 沉默 基因能够抑制 细胞的侵袭和迁移细胞划痕实验结果显示，与 组比较，组细胞迁移能力明显降低（）；迁移和侵袭实验结果显示，与 组比较，组细胞迁移能力和细胞侵袭能力均明显降低（），见图。：细胞划痕实验（）；：实验（）；：，与 组比较。图沉默 基因能够抑制 细胞的侵袭和迁移重庆医学 年月第 卷第期讨论近年来，的发病率不
11、断上升，许多患者经治疗后仍有转移和复发的风险，年生存率改善不明显，。有报道指出，即使在成功的治疗干预后，晚期肿瘤的潜在威胁及最终遍及整个上呼吸道消化道广泛的多灶性疾病也会损害长期预后。探索影响肿瘤细胞转移的相关因子及机制，对于寻找治疗 的新靶点提供了可能性。染色质重塑因子（，）在多种生物过程中有着重要作用，据报道染色质重塑复合物的异常表达与许多疾病和癌症有关。等 研究指出，在调节减数分裂细胞周期进程中起着关键作用，缺乏 的卵母细胞无法恢复减数分裂。此前已有多项研究报道了 对肿瘤细胞的影响，在乳腺癌、胃癌、急性白血病、卵巢癌、非小细胞肺癌等肿瘤组织中 呈 异 常 高 表 达，并 能 影 响 癌
12、症 进展。等研究表明，在人类乳腺癌中过表达，并与不良预后相关。有助于乳腺癌细胞的增殖和侵袭，敲低 表达后，乳腺癌细胞的凋亡率升高。等发现，急性髓系白血病的早期造血祖细胞过表达 ，其可能在白血病恶性造血过程中发挥重要的调节作用。这些研究表明，在癌症进展中具有重要作用。等 研究显示，在人胶质瘤中表达升高，并能够和 协同作用，通过核因子 通路促进胶质瘤的增殖、侵袭和化疗耐药。各种证据证明，与恶性肿瘤有着密切关联，并且与细胞的周期和增殖高度相关，在多数肿瘤中处于高表达状态，能够促进肿瘤进展。另外，有研究报 道，与 有 协 同 作 用 的 在 人 中过表达，并且其表达水平与 的发生、发展相关 。但 在
13、中的表达情况和作用机制还未见确切报道，所以 在 中的研究对于寻找 治疗新靶点是有意义的。本研究旨在探究 在 组织和人正常口腔组织中的表达差异，并探索 对 细胞系 增殖、迁移和侵袭的影响，为寻找 治疗靶点提供科学资料。本研究结果显示：通过对 数据库的信息挖掘，发现 在 组织中高表达，并且高表达 患者预后更差；此外，本研究利用 慢病毒干扰技术沉默 细胞系中 的表达，利用 检测 细胞的增殖能力，发现抑制 表达的 细胞其增殖能力较无意义干扰的 细胞明显降低；并且，细胞划痕、迁移和侵袭实验结果证明，敲低 表达可以降低 细胞的迁移和侵袭能力。因此，可以影响 细胞的增殖、迁移和侵袭能力。但 是通过何种途径影
14、响 细胞增殖、迁移和侵袭的具体机制尚不清楚。综上所述，本研究阐明了 在 组织中的表达情况及其对 患者预后的影响，并通过体外细胞实验验证了 对 细胞（细胞系）生物学行为的影响，为 临床治疗寻找新靶点提供了可能的理论基础，对改善 预后具有重要意义。参考文献 ，：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，重庆医学 年月第 卷第期 ，（）：，（）：，（）：谢玲玲，金素芬，贺佳妮，等 在非小细胞肺癌中存在过表达 中国医科大学学报，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：孙琼染色质重塑因子在口腔鳞癌中的表达及临床意义长治医学院学报，（）：（收稿日期：修回日期：）（上接第 页），（），游雪琴，应倩，羊芸，等 冷冻母乳喂养与胎龄 周或出生体重 早产儿巨细胞病毒感染的关系 中华围产医学杂志，（）：，：，（）：，（）：，：，（）：，：，？，（）：，（）：，：，（）：，：，？，（）：（收稿日期：修回日期：）重庆医学 年月第 卷第期
