1、1CS07.100.30C53中华人民共和国国家标准GB/T4789.35一2003代替GB/T16347一1996食品卫生微生物学检验乳酸菌饮料中乳酸菌检验Microbiological examination of food hygiene-Examination of lactic acid bacteria in yoghurt beverage2003-08-11发布2004-01-01实施中华人民共和国卫生部中国国家标准化管理委员会发布GB/T4789.35-20035.2改良MC培养基(Modified Chalmers培养基).5.30.1%美蓝牛乳培养基。5.46.5%氯化钠
2、肉汤。5.5pH9.6葡萄糖肉汤。5.640%胆汁肉汤。5.7淀粉水解培养基：见第A.7章。5.8精氨酸水解培养基：见第A.8章。5.9七叶苷培养基：见第A.10章。5.10革兰氏染色液：按GB/T4789.28规定。5.113%过氧化氢溶液：按GB/T4789.28规定，5.12蛋白胨水、靛基质试剂：按GB/T4789.28规定。5.13明胶培养基：按GB/T4789.28规定，5.14硝酸盐培养基、硝酸盐试剂：按GB/T4789.28规定。5.150.85%灭菌生理盐水。6乳酸菌菌落总数的测定6.1检验程序乳酸菌菌落总数检验程序见图1。检样作成几个适当倍数的稀释液选择2个3个适当稀释度各以
3、1mL加入火陶培养皿内每皿内加入适量改良TJA或改良MC培养基36172h3h菌落计数报告图16.2操作步骤6.2.1以无荫操作将经过充分摇匀的检样25mL(g)放入含有225mL灭菌生理盐水的灭南广口瓶内作成1：10的均匀稀释液。6.2.2用1mL灭菌吸管吸取1：10稀释液1mL,沿管壁徐徐注入含有灭菌生理盐水的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液)，振摇试管，混合均匀。6.2.3另取1mL灭菌吸管，按上述操作顺序，作10倍递增稀释液，如此每递增一次，即换用1支1mL灭菌吸管。6.2.4选择2个3个以上适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1L稀释液于灭菌平皿内
4、，每个稀释度作两个平皿。2GB/T4789.35-20036.2.5稀释液移入平皿后，应及时将冷至50C的乳酸菌计数培养基（改良TJA或改良MC)注入平皿约15L,并转动平皿使混合均匀。同时将乳酸菌计数培养基倾入加有1mL稀释液检样用的灭菌生理盐水的灭菌平皿内作空白对照，以上整个操作自培养物加入培养皿开始至接种结果须在20m内完成。6.2.6待琼脂凝固后，翻转平板，置36C士1C温箱内培养72h土3h,规察乳酸菌菌落特征（见表1），选取菌落数在30300之间的平板进行计数。计算后，随机挑取五个菌落数进行革兰氏染色，显微镜检查并做过氧化氢酶试验。革兰氏阳性，过氧化氢酶阴性，无芽胞的球菌或杆菌可定
5、为乳酸菌。根据证实为乳酸菌菌落计算出该皿内的乳酸菌数，然后乘其稀释倍数即得每毫升样品中乳酸菌数。例如，检样10-的稀释液在改良TJA琼脂平板上，生成的可疑菌落为35个，取五个鉴定，证实为乳酸菌的是四个，则1mL检样中乳酸菌数为：354/510=2.81056.3乳酸菌在改良TJA和改良MC培养基上菌落生长形态特征见表1。表1乳酸菌在不同培养基上菌落特征改良TJA改良MC平皿底为黄色，菌落中等大小，微白色，湿润，平皿底为粉红色，菌落较小，圆形，红色，边缘杆菌边缘不整齐，直径3mm土1mm,如棉絮团状菌落似星状，直径2mm土1mm,可有淡淡的朵平皿底为黄色，菌落光滑，湿润微白色，边缘平皿底为粉红色
6、，菌落较小，四形，红色，边缘球菌整齐整齐，可有淡淡的朵注：干酪乳杆菌在改良T丁A培养基上为圆形光滑，边缘整齐，侧面呈菱形状，7乳酸菌的鉴定对上述分离到的乳酸菌需进行菌种鉴定时，作以下试验：7.1菌种制备：自平板上挑取菌落，接种于改良TJA或改良MC琼脂斜面，于36C士1C,24h48h培养，刮取菌苔，分别进行下列试验。7.2乳酸杆菌鉴定试验：极少见还原硝酸盐，不液化明胶，不产生靛基质和硫化氢。7.3常见乳杆菌属内种的碳水化合物反应，见表2。表2常见乳杆菌属内种的碳水化合物反应七叶苷纤维二糖麦芽糖甘露醇水杨苷山梨醇蔗树干酯乳杆菌dd干留亚种保加利亚乳杆菌咯酸乳杆菌+十+乳酸乳杆菌+注：d有些菌株阳性，有些菌株阴性：#弱、慢或阴性。7.4产乳酸的链球菌的鉴别试验，见表3。表3产乳酸的链球菌的鉴别表生长试险加热0.1%6.5%40%pH水解水解10C45C60C美蓝牛乳氯化钠胆汁9.6淀粉精氨酸30 min咯热链球菌+乳链球菌+d+乳脂链球菌dd注：d有些菌株阳性，有些菌株阴性。3
