1、Research paper 研究论文 22 March 2023,42(3):719-730 菌物学报 Mycosystema ISSN1672-6472 CN11-5180/Q Doi:10.13346/j.mycosystema.220229 *Corresponding author.E-mail: Received:2022-06-21;Accepted:2022-09-06 Copyright 2023 Institute of Microbiology,CAS.All rights reserved.| Http:/journals- Tel:+86-10-64807521 菌物
2、学报 719 高效纤维素降解菌 Flavodon sp.x10 的酶学活性 王宝腾，卓也，金锋杰*，于星烨，扈爽，金龙，王震东 南京林业大学 江苏省南方现代林业协同创新中心，江苏 南京 210037 摘 要：为了筛选高效纤维素降解真菌，本研究利用采集的江苏省盐城东台杨树人工林土壤凋落物作为分离样品，通过在纤维素为碳源的选择培养基上进行培养、结合刚果红染色筛选出透明圈较大的纤维素降解菌株。通过对筛选的菌株酶活测定和比较，发现了一株高效纤维素降解真菌。根据菌株形态和 ITS 序列分析将其鉴定为黄囊孔菌 Flavodon 的一个种，命名为 Flavodon sp.x10。该菌株菌丝呈白色，无孢子产生
3、，能利用自然界中的大部分碳源，适应能力较强。纤维素相关酶活测定结果表明Flavodon sp.x10的滤纸酶活为0.138 8 U/mL，内切型-葡聚糖酶活为0.359 2 U/mL，微晶纤维素酶活为 0.135 8 U/mL，-葡萄糖苷酶活为 0.122 1 U/mL。在基础培养基中加入 20.0 g/L 葡萄糖，5.0 g/L 蛋白胨，0.01 g/L 维生素 B1，1.0 g/L 磷酸二氢钾，0.5 g/L 七水硫酸镁，0.2 g/L 碳酸钙，0.3 g/L七水硫酸锌，能够较大提高菌株产酶能力。根据酶活数据分析，纤维素降解过程中微晶纤维素酶起主导作用，-葡萄糖苷酶起次要作用，内切型-葡聚
4、糖酶对于纤维素降解作用最低。Flavodon sp.x10 可作为潜在的开发菌种用于纤维素生物降解的研究。关键词：纤维素降解真菌；纤维素酶；酶活特性 引用本文 王宝腾，卓也，金锋杰，于星烨，扈爽，金龙，王震东，2023.高效纤维素降解菌 Flavodon sp.x10 的酶学活性.菌物学报，42(3):719-730 Wang BT,Zhuo Y,Jin FJ,Yu XY,Hu S,Jin L,Wang ZD,2023.Enzyme activities of a high-efficiency cellulose degrading fungus Flavodon sp.x10.Mycosy
5、stema,42(3):719-730 Enzyme activities of a high-efficiency cellulose degrading fungus Flavodon sp.x10 WANG Baoteng,ZHUO Ye,JIN Fengjie*,YU Xingye,HU Shuang,JIN Long,WANG Zhendong Co-Innovation Center for Sustainable Forestry in Southern China,Nanjing Forestry University,Nanjing 210037,Jiangsu,China
6、Abstract:A high-efficiency cellulose-degrading fungus was screened from soil litter of poplar plantation in Dongtai,Yancheng,Jiangsu Province.The fungus formed large transparent circles on a selective medium using cellulose as a carbon source.Based on the morphology and ITS 王宝腾 等/高效纤维素降解菌Flavodon sp
7、.x10的酶学活性 研究论文 菌物学报 720 phylogenetic analysis,the fungus was identified as a strain of the genus Flavodon,named Flavodon sp.x10.The mycelia of the strain were white and produced no spores.The activities of the filter paper enzyme,endo-glucanase,avicelase,and-glucosidase,were 0.138 8,0.359 2,0.135 8,
8、and 0.122 1 U/mL,respectively.The addition of 20.0 g/L glucose,5.0 g/L protein,0.01 g/L vitamin B1,1.0 g/L potassium dihydrogen phosphate,0.5 g/L magnesium sulfate hetahydrate,0.2 g/L calcium carbonate,and 0.3 g/L zinc sulphate hetahydrate could greatly improve the enzyme production capacity of the
9、strain.Comparative analysis of the enzyme activity data shows that,avicelase plays a leading role in cellulose degradation,and-glucosidase a secondary role,while endo-glucanase has a relatively low effect on cellulose degradation.Hopefully Flavodon sp.x10 can be used as a potential valuable strain f
10、or cellulose biodegradation.Keywords:cellulose-degrading fungus;cellulase;properties of enzymatic viability 在森林生态系统中，植物体有机物主要以凋落物形式回到土壤(魏玉莲和戴玉成 2004)。森林每年净生产量的 90%以凋落物的形式返回地面，难以快速降解，积存在森林下层(Loranger et al.2002；强学彩等 2004；Sun et al.2018)。大部分碳都是以木质纤维素的形式存在于森林土壤表面的凋落物之中。除了在森林生态系统中，纤维素难以被降解利用外，在农田生态系统中，富
11、含纤维素的各种作物秸秆也很难得到有效的处理，大部分遗留在田间地头，造成各种环境问题(吴群红和郝艳华 2018；潘知乐等 2019；Xu et al.2019；于慧娟和郭夏丽 2019)。纤维素降解菌在自然环境中分布广泛，对于全球碳循环具有十分重要的意义(Maguire 1994)。在自然界中筛选具有纤维素降解能力的微生物(谢洁等 2016；田凤鸣等 2018；张云峰等 2018；李豪等 2019)是研究纤维素降解和全球碳循环的途径之一。白旭明(2017)在新疆艾比湖湿地国家级自然保护区这种荒漠型环境中分离出多种纤维素降解细菌，其中有 3 种细菌纤维素水解酶活性高，菌株适应能力强，具有较强的工业
12、应用潜力。另外在畜牧业饲料处理方面，纤维素降解菌的筛选和应用也较为深入，张云峰等(2018)在堆肥处和林间腐殖质分离出多种纤维素降解真菌和细菌，通过与目前市面上使用的菌剂对比分析其纤维素酶活，确定分离出来的纤维素降解微生物具有开发潜力。杨伟平等(2019)在动物粪便中分离出多种纤维素降解细菌，开发其在动物除臭剂应用的能力。目前已筛选出的纤维素降解菌株经过鉴定有真菌和细菌(邓梅葵等 2014；毛婷等 2019；杨祝良 2020)，但是一般在工业生产中得到广泛应用的是丝状真菌。研究发现，与细菌相比，丝状真菌产纤维素酶的能力更强，所产酶活性高、酶系全、更重要的是可以分泌到细胞外。目前，发现可大量分泌
13、纤维素酶的丝状真菌有粗糙脉孢菌 Neurospora crassa、里氏木霉 Trichoderma reesei、黑曲霉 Aspergillus niger 和草酸青霉Penicillium oxalicum 等，其中里氏木霉被广泛应用于工业化生产(Martina et al.2012；Ransom-Jones et al.2012)。马鸿飞等(2018)和曹永佳等(2021)通过优化菌体产酶条件，提升了纤维素降解真菌对木质纤维素的降解能力，为天然纤维素酶的利用和木质纤维素降解奠定了理论基础。万里强等(2011)研究表明，青贮苜蓿中加入纤维素酶能发酵纤维素分解产生戊糖、乳酸和少量乙酸，而无C
14、O2生成，有利于抑制腐败菌生长，提高饲料的贮藏期。张立霞等(2016)在用多种纤维素分解菌组合对玉米秸秆的发酵中，发现黑曲霉+青霉+木霉的组合可以有效地降解纤维素、半纤维素和木质素，降解率分别为 29.60%、12.02%和29.10%。王纪辉等(2015)在使用含纤维素分解菌Research paper 22 March 2023,42(3):719-730 Mycosystema ISSN1672-6472 CN11-5180/Q 菌物学报 721 的混合菌剂发酵玉米秸秆时发现，玉米秸秆中的纤维素和木质素得到了有效的降解。另外，由于造纸厂和糖浆厂排放的黑色污水中含有大量的木质纤维素，难以净
15、化处理，所以部分具有木质素纤维素降解能力的真菌还被应用于黑色污水处理之中。已有研究表明在废水池中加入Flavodon flavus 能够有效降解木质纤维素，净化水体(Contato et al.2020)。本研究的土壤凋落物样品取自中国东部黄海沿岸江苏省的一个杨树人工林。该地区属于亚热带和暖温带之间的过渡地区，具有海洋性和季风性气候。本研究根据形态学特征和分子鉴定结果，从该地区土壤凋落物中分离出一个高效纤维素降解真菌黄囊孔菌 Flavodon sp.x10，它的纤维素降解特性被进一步分析和阐述。1 材料与方法材料与方法 1.1 纤维素降解真菌的分离和筛选 1.1.1 样地介绍 取样地点位于江苏
16、省盐城市黄海森林公园(12049E，3252N)，临近黄海，气候是过渡地带海洋性季风气候，年平均温度 14.6，年平均降雨 1 050 mm，年平均相对湿度 88.3%，无霜期 225 d，年日照 2 200 h。土壤为脱盐草甸土，砂质土壤，pH 偏碱性。1.1.2 试剂和培养基 羧甲基纤维素钠固体培养基(CMC-Na)：羧甲基纤维素钠 10.0 g/L，蛋白胨 3.0 g/L，酵母膏0.2 g/L，硫酸铵 2.0 g/L，磷酸二氢钾 4.0 g/L，七水硫酸镁 0.3 g/L，琼脂 20.0 g/L。种子培养基：羧甲基纤维素钠 10.0 g/L，蛋白胨 3.0 g/L，磷酸二氢钾 4.0 g/L，七水硫酸镁 0.3 g/L。CMC-Na液体培养基：羧甲基纤维素钠 10.0 g/L，蛋白胨3.0 g/L，酵母膏 0.2 g/L，硫酸铵 2.0 g/L，磷酸二氢钾 4.0 g/L，七水硫酸镁 0.3 g/L。马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA，BD Difco)。察氏培养基(CYA，翼飞雪生物科技)。0.1%刚果红溶液：0.1 g刚果红溶到 100 mL 无菌水中，过滤灭菌待用。1 mol/
