1、2023/6/25,RNA,第一页，共四十九页。,2023/6/25,人类细胞质RNA提取RT-PCR的原理、方法琼脂糖凝胶电泳结果(ji gu)分析及其应用,主要(zhyo)内容,第二页，共四十九页。,人类(rnli)细胞质RNA提取,第三页，共四十九页。,2023/6/25,电泳(din yn),PCR,提取(tq)总RNA,合成(hchng)cDNA第一链,第四页，共四十九页。,2023/6/25,真核细胞RNA的种类(zhngli),真核细胞总RNA主要由rRNA（80-85%）、tRNA和核内小分子RNA(10-15%)、mRNA（1-5%）组成，其中rRNA、tRNA和mRNA位于
2、(wiy)细胞质中。大多数真核细胞mRNA在其3端均有一多聚A(Poly A)尾巴。,第五页，共四十九页。,2023/6/25,实验(shyn)前的准备,RNA实验失败的主要原因是RNA酶的污染(wrn)。由于RNA酶广泛存在而稳定，可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等，只要存在少量的RNA酶就会引起RNA的降解，而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果，所以建立一个无RNA酶的环境对于制备RNA很重要。,第六页，共四十九页。,2023/6/25,常用(chn yn)的RNA酶抑制剂,1、焦磷酸二乙酯（DEPC）：与RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合，进而使RNA酶
3、失活，有高致癌性。（实验准备阶段使用）2、异硫氰酸胍、氯仿：提取RNA同时也使RNA酶失活。3、RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘(tipn)中提取得来的酸性糖蛋白。（合成cDNA阶段使用）,第七页，共四十九页。,2023/6/25,实验(shyn)原理,Trizol试剂盒是一种苯酚与异硫氰酸胍(GTC)的混合物，异硫氰酸胍可裂解细胞，促使(csh)核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离。加入氯仿可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚促使RNA进入水相，离心后，RNA保留在水相中，DNA和蛋白质保留在有机相中。转移水相，加入异丙醇沉淀RNA，从而得到纯化的总RNA。,第八页，共四十九页
4、。,2023/6/25,提取(tq)RNA,（一）、准备(zhnbi)试剂,氯仿异丙醇75乙醇无RNase的水或0.5SDS(溶液均需用(x yn)DEPC处理过的水配制),第九页，共四十九页。,2023/6/25,提取(tq)RNA,（二）、操作步骤,取材:用生理盐水漱口后，含生理盐水约23min，用15ml离心管（4000rpm 5min）收集细胞(xbo)(同管多次离心)，弃上清沉淀中加入1ml TRIzol，旋涡震荡10 s 重悬沉淀，加样枪打匀溶液后转移至1.5ml EP管，1530放置5min 加入0.2 ml氯仿，用手摇晃15 s，1530放置5min12000rpm离心15mi
5、n,第十页，共四十九页。,2023/6/25,提取(tq)RNA,（二）、操作步骤,小心吸取上清，转移至新的1.5ml Ep管，加入等体积的异丙醇，1530放置10min12000rpm离心15min，小心去上清，加入1ml 70%乙醇，震荡数秒(sh mio)，8000rpm离心5min 小心去上清，室温干燥5min，加入10ul DEPC水，打匀55水浴10分钟助溶,第十一页，共四十九页。,2023/6/25,提取(tq)RNA,（三）、注意事项,1、塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡12h以上，高压灭菌。2、有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2
6、室温(sh wn)10min，然后用0.1%DEPC水冲洗，晾干。3、所有的玻璃器皿均应在使用前于180的高温下干烤6h或更长时间。4、配制的溶液应尽可能用0.1%DEPC在37处理12h以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经滤膜过滤除菌。5、操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。,第十二页，共四十九页。,2023/6/25,提取(tq)RNA,（三）、注意事项,6、设置RNA操作专用实验室，所有器械(qxi)等应为专用。7、防止RNA酶污染（1）RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等（2）严格控
7、制外源性RNA酶的污染：外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中，造成器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂的污染。（3）最大限度地抑制内源性的RNA酶；而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。,第十三页，共四十九页。,2023/6/25,RNA保存(bocn),溶解在无RNase的水或TE中，在-70或更低温度中保存时间在一年以内，但避免反复冻融，应分装保存。从富含RNase的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的RNA需溶解在去离子甲酰胺中存于-70，至少可以保存一年。需使用RNA时，可以加入(jir)NaAc至终浓度0.3M，12000g离心5分钟，
8、70%乙醇洗涤后再用无RNase的水或TE溶解。,第十四页，共四十九页。,RT-PCR的原理(yunl)、方法,第十五页，共四十九页。,2023/6/25,实验(shyn)原理,1、单拷贝基因表达存在逐步放大机制。2、PCR技术，即聚合酶链式反应。反应分三步：变性，退火(tu hu)，延伸。3、逆转录酶。可以以RNA为模板合成cDNA第一条链，或者以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA。,pr,incipe,does matter,可见，RT-PCR是一种将cDNA合成与PCR技术结合分析基因表达(biod)的快速灵敏的方法。,第十六页，共四十九页。,RNA 模板(mbn),逆转录酶,D
9、NA-RNA 杂化双链,RNase降解(jin ji)RNA,单链DNA,DNA聚合酶,cDNA,RT-PCR,Taq酶,第十七页，共四十九页。,2023/6/25,1、引物的特异性决定PCR反应特异性。2、引物设计原则的把握：（1）引物长度:一般为1530bp（2）碱基分布（3）3端要求（4）引物自身二级结构(jigu)（5）引物之间的二级结构（6）同源序列（7）5端无严格限制,操作步骤,（一）引物设计(shj),第十八页，共四十九页。,2023/6/25,操作步骤,（二）RNA的提取(tq),第十九页，共四十九页。,2023/6/25,操作步骤,（二）RNA的提取(tq),第二十页，共四十
10、九页。,2023/6/25,（1）两步法RT-PCR,操作步骤,（三）cNDA合成(hchng),a常用的反应(fnyng)体系10RT反应缓冲液 2uldNTP Mixture（各10mM）2ulRNAase inhibitor(40U/ul)0.5uloligo(dT)18 1ul逆转录酶 1ul总RNA 0.51ugDEPCfree水 补足体系至20ul,第二十一页，共四十九页。,2023/6/25,（1）两步法RT-PCR,操作步骤,（三）cNDA合成(hchng),b操作(cozu),在发给(f i)每人一份的已制备分装的逆转录反应管里加入8ul 总RNA溶液,0.2ml Ep管，迷
11、你离心机离心数秒，放置PCR仪中,42 30min（合成cDNA第一链）85 5min（灭活逆转录酶）,第二十二页，共四十九页。,2023/6/25,（2）一步法RT-PCR,操作步骤,（三）cNDA合成(hchng),在一步法RT-PCR中，逆转录和PCR在同时为逆转录和PCR优化的条件下，在同一管内进行。优势：在处理(chl)大量样品时易于操作；减少残余污染；可以得到更高的灵敏度。缺点：无法优化反应条件；一旦失败，必须重新提取总RNA。,第二十三页，共四十九页。,2023/6/25,（2）一步法RT-PCR,操作步骤,（三）cNDA合成(hchng),0.1-1ug 总RNA 200一50
12、0 umol/L的dNTP(每种)0.5umolL 基因(jyn)特异引物（上下游）200 U AMV逆转录酶 1Taq聚合酶缓冲液 0.5-15mmolL MgCI2 1 mmo1L DTT 1.5U Taq聚台酶 终体积为50ul。,第二十四页，共四十九页。,2023/6/25,（1）50ulPCR体系(tx)的组成（即一步法）：,操作步骤,（四）PCR扩增,第二十五页，共四十九页。,2023/6/25,（2）PCR反应(fnyng)过程：,操作步骤,（四）PCR扩增,第二十六页，共四十九页。,2023/6/25,（1）引物退火温度的调节(tioji)，一般在引物设计软件推荐温度的上下2
13、变化寻找最佳退火温度。（2）此外Mg2 浓度的调节也非常重要，通常最佳浓度为2mM左 右。（3）引物和模板的量等。,操作步骤,（五）PCR条件(tiojin)的优化,第二十七页，共四十九页。,2023/6/25,根据产物长度制作适宜浓度的琼脂糖凝胶（不同长度产物所需凝胶浓度）。取适量PCR产物，加上样缓冲液充分(chngfn)混合，点样于事先做好的琼脂糖凝胶点样孔中，10V/cm电泳4560min。成像系统成像分析。,操作步骤,（六）产物的电泳(din yn)和结果的测定,第二十八页，共四十九页。,琼脂糖凝胶电泳结果(ji gu)分析及其应用,第二十九页，共四十九页。,2023/6/25,实验
14、(shyn)原理,1、琼脂糖为链状多糖 绳状琼脂糖束大网孔型凝胶 分离(fnl)、鉴定、纯化DNA2、影响DNA迁移率的因素：DNA分子的大小、构象，凝胶浓度，电压，电泳缓冲液的组成,pr,incipe,does matter,第三十页，共四十九页。,2023/6/25,染色(rns)和照相,电泳(din yn),样品(yngpn)的制备与加样,选择电泳类型,选择电泳缓冲体系,琼脂糖凝胶的制备,第三十一页，共四十九页。,2023/6/25,选择电泳(din yn)类型,用于分离核酸的琼脂糖凝胶电泳可分为垂直型及水平(shupng)型（平板型）。,STEPS,does matter,第三十二页，
15、共四十九页。,2023/6/25,选择(xunz)缓冲液系统,常用的电泳缓冲液有EDTA（pH8.0）和Tris-乙酸（TAE），Tris-硼酸(pn sun)（TBE）或Tris-磷酸（TPE）等，浓度约为50mmol/L(pH7.57.8)。,STEPS,does matter,第三十三页，共四十九页。,2023/6/25,凝胶的制备(zhbi),以稀释的电泳缓冲液为溶剂，用微波炉配制一定浓度的溶胶，灌入水平(shupng)胶框或垂直胶膜，插入梳子，自然冷却。,STEPS,does matter,第三十四页，共四十九页。,2023/6/25,样品(yngpn)配制与加样,DNA样品用适量T
16、ris-EDTA缓冲液溶解，缓冲液内含有0.25%溴酚蓝或其他(qt)指示染料，含有10%-15%蔗糖或5%10%甘油，以增加其比重，使样品集中。,STEPS,does matter,第三十五页，共四十九页。,2023/6/25,电泳(din yn),在低电压条件下，线性DNA分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比。因此为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度(qingd)不宜高于5V/cm。,STEPS,does matter,第三十六页，共四十九页。,2023/6/25,染色(rns)与照相,常用荧光染料溴乙锭（EB）染色，在紫外光下观察DNA条带，用紫外分析仪拍照，或用凝胶成像系统(xtng)输出照片，并进行有关的数据分析。,STEPS,does matter,第三十七页，共四十九页。,第三十八页，共四十九页。,2023/6/25,结果(ji gu)分析,（一）、影响(yngxing)琼脂糖凝胶电泳的因素,DNA分子的大小：实验证明，DNA片段(pin dun)迁移距离与其分子量的对数成反比；琼脂糖的浓度：一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂凝胶中，电泳迁移率不相同；DNA分
