1、课题2土壤中分解尿素的细菌的别离与计数,专题2微生物的培养与应用,第一页，共三十二页。,一、课题背景,1、尿素的利用,尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。,2、细菌利用尿素的原因,土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶,第二页，共三十二页。,3、常见的分解尿素的微生物,芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。,4、课题目的,从土壤中别离出能够分解尿素的细菌,统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌,一.研究思路,.筛选菌株,.统计菌落数目,.设置对照,第三页，共三十二页。,1、
2、实例：,启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。,原因：因为热泉温度70800C，淘汰了绝大多数微生物只有Taq细菌被筛选出来。,DNA多聚酶链式反响是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温930C的DNA聚合酶。,第四页，共三十二页。,要别离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等；方法：抑制大多数微生物不能生长造成有利于该菌生长的环境，结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯化培养别离。,2、实验室中微生物的筛选原理：,人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止
3、其他微生物生长。,第五页，共三十二页。,3、土壤中分解尿素的细菌的别离与计数所需培养基：,从物理性质看此培养基属于哪类？,固体培养基,第六页，共三十二页。,在此培养基中哪些作为碳源、氮源？,碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素,培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。,5、培养基选择分解尿素的微生物的原理,第七页，共三十二页。,1、显微镜直接计数：,利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。,.统计菌落数目：,不能区分死菌与活菌；不适
4、于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；,缺点,第八页，共三十二页。,2.间接计数法活菌计数法原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。常用方法：稀释涂布平板法。,每克样品中的菌落数(CV)M其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。,第九页，共三十二页。,本卷须知为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板上进行计数。为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。统计的
5、菌落往往比活菌的实际数目低。涂布平板法所选择的稀释度很重要，一般以三个稀释度中的第二个稀释度所出现的平均菌落数在50个左右为最好。,第十页，共三十二页。,计数法,直接计数法、平板计数法、比浊法、膜过滤法,第十一页，共三十二页。,例题：统计菌落数目的方法有,A.B.C.D.,D,涂布平板法 重量法 直接计数法 比浊法 生理指标法 膜过滤法,第十二页，共三十二页。,设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。,.设置对照：,实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释
6、度下只选择出大约50个菌落。分析其原因。,原因：土样不同，培养基污染或操作失误(或者是混入了其他的含氮物质),第十三页，共三十二页。,小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。,方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验,方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。,结果预测：如果结果与A同学一致，那么证明A无误；如果结果不同，那么证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。,第十四页，共三十二页。,二.实验的具体操作.土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信
7、封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。.制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。,第十五页，共三十二页。,应在火焰旁称取土壤10g。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行,别离不同的微生物采用不同的稀释度原因：不同微生物在土壤中含量不同目的：保证获得菌落数在30300之间、适于计数的平板,三样品的稀释,第十六页，共三十二页。,为什么别离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？,原因：土壤中各类微生物的数量单位：株/kg是不同的。例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2 185万
8、，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。结论：为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行别离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。,第十七页，共三十二页。,.取样涂布,实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。,如果得到了2个或2个以上菌落数目在30300的平板，那么说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，说明试验不精确，需要重新实验。,第十八页，共三十二页。,.微生物的培养与观察,在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间缺乏而导致遗漏菌落的数目。,培
9、养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌：3037培养12d放线菌：2528培养57d霉菌：2528的温度下培养34d。,第十九页，共三十二页。,微生物的培养与观察,第二十页，共三十二页。,三.结果分析与评价1.通过对照实验，假设培养物有杂菌污染，菌落数偏高；假设培养物混入其他氮源，那么菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。2.提示：选择每个平板上长有30300个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最适宜。同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。,第二十一页，共三十二页。,四、操作提示,无菌操作,做好标记,规划时间,第二十二页，共三十二页。,五.课外延伸
10、 在以尿素为唯一氮源的培养基中参加酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。,测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红美蓝 培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。,第二十三页，共三十二页。,大肠杆菌呈 黑色中心,有或无金属光泽,大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)上典型特征,第二十四页，共三十二页。,本课题知识小结:,第二十五页，共三十二页。,六、例题解析,例1对细菌群体生长规律测定的正确的表述是A在液体培养基上进行 B至少接种一种细菌 C接种一个细菌 D及时补充消耗的营养物质,解析：细菌
11、群体生长规律的测定是人们在一定条件下进行的。这些条件是：一种细菌、恒定容积的培养基，液体培养基、定时测定细菌总数。在这些条件下，才能测定出细菌的生长规律。测定时只能用一种细菌的子细胞群体的变化规律表达微生物的生长；恒定容积是给微生物提供一定的生存环境；液体培养基才能通过样品推测细菌总数。假设接种多种细菌，那么会发生种间斗争而不能测定一种微生物的生长规律。在接种时，要保证一定的接种量。,答案：A,第二十六页，共三十二页。,例2在微生物群体生长规律的测定中，种内斗争最显著最剧烈的时期是A调整期 B对数期 C稳定期 D衰亡期,解析：种内斗争是一种生态因素。种内斗争反响了种内生物对生存空间和生活资源的
12、争夺。在生活空间充裕，营养充足的时候，种内斗争的程度是比较低的。随着微生物个体数目的增加，每个个体的生存空间越来越少，营养物质也越来越少，每个个体对生存空间和资源的争夺也越来越剧烈，种内斗争就越来越剧烈。由此可知，在稳定期的种内斗争最剧烈。在衰亡期，微生物的数目已经开始减少，pH已经极度不适于微生物的生存，次级代谢产物积累到很高的程度，这时的微生物的生存斗争主要是与无机环境的斗争。,答案：C,第二十七页，共三十二页。,1.对细菌群体生长规律测定的正确的表述是 A.在液体培养基上进行 B.至少接种一种细菌 C.接种一个细菌 D.及时补充消耗的营养物质 2.使用选择培养基的目的是 A.培养细菌 B
13、.培养真菌 C.使需要的微生物大量繁殖 D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是()A.CO2和N2 B.葡萄糖和NH3 C.CO2和尿素 D.葡萄糖和尿素,实践训练,A,C,D,第二十八页，共三十二页。,4.以下说法不正确的选项是 A.科学家从7080度热泉中别离到耐高温的TaqDNA聚合酶 B.统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、M3、M4、M5，以M3作为该样品菌落数的估计值 C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度 D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。
14、5.为培养和别离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中参加 A.较多的氮源物质 B.较多的碳源物质 C.青霉素类药物 D.高浓度食盐,B,C,第二十九页，共三十二页。,例32005年江苏抗生素作为治疗细菌感染的药物，其高效性和巨大的经济价值使抗生素工业经久不衰。其中青霉素的发现和应用具有划时代的意义。青霉素发酵产生青霉素。青霉菌的新陈代谢类型是，青霉素是青霉菌的 代谢产物。在生产和科研中，常选用处于 期的青霉菌作为菌种或研究材料，因为此时的青霉菌代谢旺盛，和 比较稳定。对青霉菌菌体生长情况的测定：取一定体积的发酵液，经离心别离、反复洗涤后，再计算发酵罐中菌体的总重量。,异养需氧型,次级,对数,个体的形态,生理特性,称菌体的湿重 称烘干后的重量,第三十页，共三十二页。,下课了,第三十一页，共三十二页。,内容总结,课题2。启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。DNA多聚酶链式反响是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温930C的DNA聚合酶。为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板上进行计数。2.提示：选择每个平板上长有30300个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最适宜。在接种时，要保证一定的接种量。青霉素发酵产生青霉素。下课了,第三十二页，共三十二页。,
