1、流式细胞术在科研(k yn)中 的应用,第一页，共五十五页。,什么(shn me)是流式细胞仪,流式细胞仪实物(shw),BD FACSVantage,BD-Calibur,第二页，共五十五页。,流式细胞(xbo)仪可检测到的细胞(xbo)参数,非荧光(ynggung)信号,颗粒(kl)度,细胞大小,前向角散射光（FSC）细胞相对大小及其表面积 侧向角散射光（SSC）细胞颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性,第三页，共五十五页。,外周全(zhuqun)血细胞散射光双参数点图,第四页，共五十五页。,荧光(ynggung)信号,荧光强度（FL）：细胞上的荧光染料被激光激发后发射出的荧光，不同的荧光染料
2、其发射波长(bchng)不同。有荧光标记的细胞与无荧光标记的区分开来（阴阳）高FL细胞与低FL细胞区分开来（强弱）一般的流式细胞仪只装有一个激光光源（488nm），可测出三个FL，即FL1、FL2、FL3，大型的流式细胞仪装有两个或三个激光光源（488nm、633nm和325nm），可测出6个FL。,第五页，共五十五页。,荧光(ynggung)信号,双色直接(zhji)染色,第六页，共五十五页。,流式报告的图一般分为四种，即散点图、直方图、密度图和二维等高图等。最常用的为散点图和直方图。几个概念：%Gated：阳性细胞百分比。反映细胞群体中阳性细胞的数量。Mean：平均荧光强度，与被检测物质(
3、wzh)的表达量有关，在正态分布时一般用该值。Geo Mean：几何平均荧光强度，在阳性细胞为偏态分布时一般用该值。,第七页，共五十五页。,散点图,密度(md)图,二维等高图,直方图,图 报告(bogo)中常见的几种流式细胞图,第八页，共五十五页。,图 Annexin V/PI双标记(bioj)分析细胞凋亡和坏死,第九页，共五十五页。,流式细胞仪数据分析,点图分析(fnx),第十页，共五十五页。,流式细胞仪数据分析,直方图分析(fnx),第十一页，共五十五页。,图中100101（M1）为阴性(ynxng)细胞，101以上的（M2）为阳性细胞,第十二页，共五十五页。,当前(dngqin)流式细胞
4、分析发展趋势,从相对(xingdu)细胞计数到绝对细胞计数 从相对定量到绝对定量分析从单色到多色荧光分析 从细胞膜成分到细胞内成分分析从细胞分析到可溶性成分的流式细胞分析,第十三页，共五十五页。,今天主要(zhyo)内容：,流式细胞术在细胞凋亡检测中的应用(yngyng)流式细胞术在肿瘤细胞DNA倍体中的应用流式细胞仪的分选功能流式细胞术在蛋白检测中的应用,第十四页，共五十五页。,细胞(xbo)凋亡检测,第十五页，共五十五页。,1、半胱氨酸蛋白酶3检测法（早早期）2、Annexin V-FITC/PI 法（早期）3、Apo2.7检测法（早期）4、TUNEL 法（晚期）5、DNA含量分析法（晚晚
5、期）6、细胞凋亡相关(xinggun)蛋白的流式细胞术检测,流式细胞术检测(jin c)细胞凋亡,第十六页，共五十五页。,细胞(xbo)凋亡的分析,细胞凋亡的主要(zhyo)表现细胞内水解酶改变：如Caspase-3活化细胞膜不对称性改变，磷脂酰丝氨酸外翻，但仍然保持膜的完整性：Annexin V/PI细胞核DNA的断裂改变：TUNNEL实验（APO-BRDU，APO-DIRECT）凋亡相关蛋白：FasBcl-2,第十七页，共五十五页。,细胞(xbo)凋亡Active Caspases-3,第十八页，共五十五页。,细胞(xbo)凋亡Caspases-3,第十九页，共五十五页。,细胞(xbo)凋
6、亡Annexin,第二十页，共五十五页。,凋亡(dio wn)检测（Annexin V/PI法）,第二十一页，共五十五页。,DNA倍体的流式分析(fnx),第二十二页，共五十五页。,细胞DNA含量(hnling)检测,细胞固定后用PI（Propidium iodide碘化丙啶），染色，因为PI特异性结合于细胞DNA，荧光强度与PI的结合量呈良好的线性关系，根据这个原理，可测出细胞的DNA含量(hnling)。用于细胞周期、细胞倍体以及凋亡的检测。,第二十三页，共五十五页。,第二十四页，共五十五页。,单参数(cnsh)直方图,图中2N代表(dibio)G0/G1期细胞，4N代表(dibio)G2
7、/M期细胞，两者中间代表(dibio)S期细胞。这是以2倍体和4倍体细胞为主的流式DNA图,第二十五页，共五十五页。,DNA细胞周期分析(fnx),细胞周期,G2,M,G0,G1,s,200,400,600,800,1000,s,DNA分析(fnx),DNA含量(hnling),细胞数量,第二十六页，共五十五页。,第二十七页，共五十五页。,2倍体,异倍体,4倍体,肿瘤(zhngli)组织中的各种DNA倍体,第二十八页，共五十五页。,含量(hnling)与凋亡关系,DNA亚G1峰的检测：利用PI染色，检测具有亚G1期DNA含量的细胞比例，代表凋亡细胞数。凋亡过程中，细胞内核酸酶的释放，将DNA降
8、解，分解成小的片段，在标本制备(zhbi)中的固定处理时，细胞膜的完整性被破坏，使细胞内降解的DNA片段从细胞内流出，造成总体DNA含量减少，成为亚2倍体。,第二十九页，共五十五页。,第三十页，共五十五页。,第三十一页，共五十五页。,Date acquired:14-Jan-03File:7Gy 4hr.001Source:dongboDIPLOID:100.00%Dip G0-G1:73.12%at 48.16 Dip G2-M:9.59%at 96.33 Dip S:17.29%G2/G1:2.00 Dip%CV:6.04Apoptosis:13.66%Mean:27.48,图 FCM测试
9、细胞(xbo)周 期分布和凋亡,第三十二页，共五十五页。,流式细胞(xbo)仪的细胞(xbo)分选功能,第三十三页，共五十五页。,分选：,用荧光探针标记的细胞，可被有效地分离出来，用于分选的效率较高的仪器国内较少，台式机一般(ybn)分选速度为每秒钟300个细胞，大型机分选速度可达到每秒上万个细胞,第三十四页，共五十五页。,488 nm laser,-,Fluorescence Activated Cell Sorting,Charged Plates,Single cells sortedinto test tubes,FALS Sensor,Fluorescence detector,第三
10、十五页，共五十五页。,流式分选与分子生物学研究(ynji),除了将分选得到的细胞(xbo)进行后续培养研究外，FCM分选系统可为PCR、FISH等分子技术提供纯度较高的特异性细胞(xbo)群，减少研究中的干扰因素，获得更准确的实验结果。,第三十六页，共五十五页。,Cytometric Beads Array(CBA)流式液相多重蛋白定量(dngling)技术,第三十七页，共五十五页。,导言(doyn),常规的蛋白分析方法：ELISA：一次反应只能检测一个指标Western blot：不能对蛋白精确定量不足之处：检测多个指标需耗费大量样本分批操作导致组间差异大操作繁琐(fn su)，耗时耗力如何
11、能够从单个微量样本中一次检测多个目标蛋白，并加以定量，获得高精确度的数据呢？针对于此，BD-Pharmingen成功研发了基于流式细胞仪检测平台的液相多重蛋白定量技术BD Cytometric Bead Array，简称CBA,第三十八页，共五十五页。,CBA技术(jsh)简介,CBA是一系列带有不同强度红色荧光、包被有捕获抗体的微球，类似(li s)ELISA的捕获孔板，可以捕获液相样本（血清、血浆或者细胞培养上清液等）中相应的抗原，再结合PE标记检测抗体，形成双抗体夹心结构，通过流式细胞仪进行荧光检测，便可同时对样本中的多种可溶性蛋白成分进行定量,+,+,Analyte of intere
12、st,Fluorescent detection Ab,capture Bead,capture Ab,Bead,第三十九页，共五十五页。,BD Cytometric Bead Array,1,2,3,不同(b tn)强度红色荧光的捕获微球，在FCM FL3检测,不同的目标(mbio)蛋白,PE 标记的检测抗体，在FCM FL2检测。PE的荧光(ynggung)强度即反映靶蛋白的含量,4,5,6,第四十页，共五十五页。,Human Th1/Th2 Lymphokine CBA,Th1/Th2 panel:IL2,IL4,IL5,IL10,TNF,IFN用 FL3荧光的强度(qingd)不同区别
13、 种不同的微球（beads）Direct sandwich immunoassayFL2(PE)detector reagent样本处理6 cytokines from a 50 L sampleThree pipetting steps3 hour total incubationQuantitative results and complete report generationSoftware assisted quantitative analysis,with curve fitting algorithmResult reporting included in software,第
14、四十一页，共五十五页。,Human Th1/Th2 Lymphokine CBA,第四十二页，共五十五页。,Chemokine-I CBA Assay Standard,0 pg/ml,CBA Assay Standard,第四十三页，共五十五页。,10 pg/ml,CBA Assay Standard cont.,Chemokine-I CBA Assay Standard,第四十四页，共五十五页。,20 pg/ml,CBA Assay Standard cont.,Chemokine-I CBA Assay Standard,第四十五页，共五十五页。,40 pg/ml,CBA Assay
15、Standard cont.,Chemokine-I CBA Assay Standard,第四十六页，共五十五页。,80 pg/ml,CBA Assay Standard cont.,Chemokine-I CBA Assay Standard,第四十七页，共五十五页。,156 pg/ml,CBA Assay Standard cont.,Chemokine-I CBA Assay Standard,第四十八页，共五十五页。,312 pg/ml,CBA Assay Standard cont.,Chemokine-I CBA Assay Standard,第四十九页，共五十五页。,625 p
16、g/ml,CBA Assay Standard cont.,Chemokine-I CBA Assay Standard,第五十页，共五十五页。,1250 pg/ml,CBA Assay Standard cont.,Chemokine-I CBA Assay Standard,第五十一页，共五十五页。,2500 pg/ml,CBA Assay Standard cont.,Chemokine-I CBA Assay Standard,第五十二页，共五十五页。,Human Th1/Th2 Lymphokine CBA 标准(biozhn)曲线,5000 pg/ml,2500 pg/ml,1250 pg/ml,625 pg/ml,312 pg/ml,80 pg/ml,20 pg/ml,IL-2IL-4IL-5IL-10TNF-IFN-,IL-2IL-4IL-5IL-10TNF-IFN-,第五十三页，共五十五页。,总结(zngji),流式细胞术检测的是处于流动状态中的被荧光素标记的微粒，包括细胞、细菌或者微球。对于可溶性抗原，只能用相应的抗体(kngt)先包被微球，再来结合抗原进行检测。流
