1、,微生物学(wi shn w xu)检验,第一页，共六十八页。,第二页，共六十八页。,第五章 细菌检验(jinyn)技术,第三页，共六十八页。,本 章 内 容,第四页，共六十八页。,本章(bn zhn)内容,学习目标：掌握：革兰染色的原理(yunl)、操作及结果判断；细菌接种技 术、培养方法、细菌在不同培养基中的生长现象、生化反应的原理(yunl)。熟悉：细菌染色标本检查的基本程序，细菌培养常用培养基和器材。了解：细菌不染色标本的检查方法和用途；免疫学技术、分子生物学技术及自动化检测技术等鉴定微生物。本章重点：革兰染色的原理、操作方法及意义 细菌培养及生长现象 细菌生化反应及临床应用,第五页，
2、共六十八页。,第一节 细菌形态检验(jinyn)技术,一、染色(rns)标本镜检（一）染色标本检查的一般程序,第六页，共六十八页。,第一节 细菌形态(xngti)检验技术,1.单染色法 细菌标本(biobn)经涂片、干燥固定后，滴加染液染色1分钟，水洗后待玻片燥后即可镜检,（二）常用(chn yn)的染色方法,第七页，共六十八页。,第一节 细菌(xjn)形态检验技术,（二）常用(chn yn)的染色方法 2.革兰染色法【方法】,第八页，共六十八页。,第一节 细菌形态(xngti)检验技术,（二）常用的染色方法(fngf)2.革兰染色法【结果】,紫色革兰阳性菌（1000）,红色革兰阴性菌（100
3、0）,第九页，共六十八页。,第一节 细菌形态检验(jinyn)技术,（二）常用的染色(rns)方法 3.抗酸染色法【结果】,抗酸染色结果（1000）：红色(hngs)为抗酸杆菌，蓝色为非抗酸杆菌,第十页，共六十八页。,第一节 细菌形态(xngti)检验技术,（三）其他(qt)染色法 1.特殊结构染色法（1）荚膜染色法,荚膜染色(rns)结果，1000,第十一页，共六十八页。,第一节 细菌(xjn)形态检验技术,（三）其他(qt)染色法 1.特殊结构染色法（2）鞭毛染色法,鞭毛染色(rns)结果，1000,第十二页，共六十八页。,第一节 细菌形态检验(jinyn)技术,（三）其他(qt)染色法
4、1.特殊结构染色法（3）芽孢染色法,芽孢染色(rns)结果，1000,第十三页，共六十八页。,第一节 细菌形态(xngti)检验技术,（三）其他染色法1.特殊结构(jigu)染色法（4）异染颗粒染色法,异染颗粒亚甲蓝染色结果：白喉(bihu)棒状杆菌，1000,第十四页，共六十八页。,第一节 细菌(xjn)形态检验技术,（三）其他(qt)染色法 2.负染色法,墨汁荚膜染色（脑脊液中的新型(xnxng)隐球菌，400）,第十五页，共六十八页。,第一节 细菌形态检验(jinyn)技术,二、不染色(rns)标本镜检 1.压滴法,压滴法镜检结果(ji gu)：尿涂片，400,第十六页，共六十八页。,第
5、一节 细菌形态检验(jinyn)技术,二、不染色(rns)标本镜检 2.悬滴法,第十七页，共六十八页。,第一节 细菌形态检验(jinyn)技术,二、不染色(rns)标本镜检 3.毛细管法,第十八页，共六十八页。,三、其他(qt)显微镜检查,第一节 细菌(xjn)形态检验技术,第十九页，共六十八页。,第二节 细菌接种与培养(piyng)技术,一、基本(jbn)条件,接种(jizhng)环,培养皿,红外接种灭菌器,第二十页，共六十八页。,培 养 箱,生物(shngw)安全柜,第二节 细菌接种(jizhng)与培养技术,一、基本(jbn)条件,第二十一页，共六十八页。,培养基成份(chng fn),
6、培养基：人工配制的适合细菌生长繁殖(fnzh)的综合营养基质。营养物质：牛肉膏、蛋白胨、肉浸液、糖醇类、血液、鸡蛋及动物血清、生长因子、无机盐等水凝固剂：琼脂、明胶抑制剂：孔雀绿、煌绿、胆盐、抗生素等 指示剂：溴麝香草酚蓝，溴甲酚紫、酚红等,第二节 细菌接种与培养(piyng)技术,第二十二页，共六十八页。,第二节 细菌接种与培养(piyng)技术,基础培养基：普通琼脂平板营养培养基：满足营养需求较高细菌的生长，如血琼脂平板、巧克力琼脂平板等鉴别培养基：含有某些特定的底物，用于鉴别细菌，如克氏双糖(shun tn)铁培养基（KIA）及各种生化反应用培养基选择培养基：具有选择性抑制非目的菌生长作
7、用，用于选择性培养目的菌，如SS平板、中国蓝琼脂平板、伊红美蓝琼脂平板等增菌培养基：用于含菌量较少的标本，如葡萄糖肉汤、GN增菌肉汤特殊培养基：厌氧培养基、L型细菌培养基,培养基种类(zhngli)（按用途分）,第二十三页，共六十八页。,培养基,第二节 细菌接种(jizhng)与培养技术,第二十四页，共六十八页。,第二节 细菌接种(jizhng)与培养技术,液体(yt)培养基,第二十五页，共六十八页。,培养基的种类(zhngli)（按物理性状分类）,液体培养基：不含凝固剂，用于增菌和接种纯种细菌。半固体培养基：含0.20.5琼脂，用于观察细菌的动力。固体培养基：含23琼脂，用于细菌的分离(fn
8、l)培养。,第二节 细菌接种与培养(piyng)技术,第二十六页，共六十八页。,第二节 细菌(xjn)接种与培养技术,培养基灭菌(mi jn),基础(jch)培养基：121高压蒸汽灭菌15分钟,含糖培养基：113 灭菌15分钟,含鸡蛋、血清培养基：间歇灭菌3天3次,不耐高温的液体成分：滤过除菌,调配溶化调Ph过滤澄清分装灭菌检定保存,培养基制备程序,第二十七页，共六十八页。,（一）无菌技术(jsh),细菌检验的操作(cozu)应在无菌室或生物安全柜内进行无菌室、生物安全柜使用前后均需进行消毒灭菌细菌检验使用过的物品使用前后需严格灭菌处理标本的采集严格无菌操作无菌试管、烧瓶的使用时注意管口灭菌,
9、第二节 细菌(xjn)接种与培养技术,二、细菌接种与培养技术,第二十八页，共六十八页。,（二）细菌接种(jizhng)与分离技术,第二节 细菌接种(jizhng)与培养技术,灭菌接种(jizhng)环（针）冷却挑取标本（细菌）接种灭菌接种环（针）,平板划线法,分区划线,连续划线,第二十九页，共六十八页。,分区(fn q)划线法,第一(dy)区划线,灭菌(mi jn)接种环,第二区划线,灭菌接种环,第三区划线,灭菌接种环,第二节 细菌接种与培养技术,第三十页，共六十八页。,连续(linx)划线法,第二节 细菌接种(jizhng)与培养技术,第三十一页，共六十八页。,斜面(ximin)接种,半固体
10、(gt)穿刺接种,液体(yt)接种,第二节 细菌接种与培养技术,第三十二页，共六十八页。,（三）细菌培养(piyng)方法,一般培养（需氧培养）：培养需氧或兼性厌氧菌培养温度：35 37 培养时间：1824小时二氧化碳培养法：烛缸法、二氧化碳(r yng hu tn)培养箱厌氧培养法：厌氧培养箱、厌氧袋、厌氧罐、疱肉培养法、硫乙醇酸盐法等培养厌氧菌,第二节 细菌接种与培养(piyng)技术,第三十三页，共六十八页。,三、细菌(xjn)的生长现象,第二节 细菌接种(jizhng)与培养技术,菌落(jnlu)与菌苔,血平板上溶血现象,第三十四页，共六十八页。,细菌在液体(yt)培养基中生长现象,第
11、二节 细菌(xjn)接种与培养技术,沿穿剌线扩散(kusn)生长,在穿剌线上生长,细菌在半固体培养基中的现象,第三十五页，共六十八页。,一、碳水化合物的代谢(dixi)试验,第三节 细菌(xjn)生化鉴定技术,原理：多糖单糖(dn tn)丙酮酸酸性产物(或产气)pH 呈酸性变色(或出现气泡)方法：将待检细菌以无菌操作接种到糖发酵管中，置35温箱培养1824h，观察结果。,1、糖（醇、苷）类发酵试验,结 果,第三十六页，共六十八页。,一、碳水化合物的代谢(dixi)试验,第三节 细菌生化(shn hu)鉴定技术,原理：根据细菌在分解葡萄糖的代谢过程中对氧分子需求(xqi)的不同，将细菌分为氧化、
12、发酵和产碱型三类,2、O/F试验,结 果,方法：取2支HL葡萄糖培养管煮沸驱氧，冷却后接种细菌。将其中一管敞开，另一管用液体石蜡封管，培养18 24h观察结果,第三十七页，共六十八页。,3、甲基红试验(shyn),第三节 细菌(xjn)生化鉴定技术,原理：细菌发酵葡萄糖，产生丙酮酸，进一步分解生成大量混合酸，使培养pH下降至4.4以下，加入甲基红后，呈现(chngxin)红色反应。为甲基红试验阳性。,方法：将待检菌种接种于葡萄糖蛋白胨水中,35培养1824小时后,往培养基中加入甲基红指示剂少许,观察结果。,结 果,第三十八页，共六十八页。,4、V-P试验(shyn),第三节 细菌生化鉴定(ji
13、ndng)技术,原理：细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸脱羧生成乙酰甲基甲醇(ji chn)，在碱性环境中，乙酰甲基甲醇(ji chn)被氧化为二乙酰，二乙酰与胍基化合物结合，生成红色化合物，是为V-P试验阳性。,方法：把待检细菌接种在葡萄糖蛋白胨水中，35培养1824h后，按每毫升培养液加入0.1ml含2肌酸或肌酐的40KOH溶液,数分钟或数小时后观察结果。,结 果,空白对照 阴性 阳性,第三十九页，共六十八页。,5、-半乳糖苷酶试验(shyn)（ONPG）,第三节 细菌生化(shn hu)鉴定技术,原理：有的细菌可产生-半乳糖苷酶，能分解(fnji)邻硝基酚-D半乳糖苷(ONPG)而生成黄色
14、的邻硝基苯酚，该试验也称为ONPG试验。,方法：将被检制成菌悬液，加入1滴甲苯充分振摇，37水浴5 分钟，使酶释放，然后再加入0.25ml ONPG，混匀后，置于37水浴中温育，菌悬液呈黄色为阳性反应。,结 果,阴性 阳性,第四十页，共六十八页。,6、七叶(q y)苷水解试验,第三节 细菌生化鉴定(jindng)技术,原理：某些细菌能分解七叶苷产生(chnshng)葡萄糖与七叶素，七叶素与培养基中的Fe2+结合后，形成黑色的化合物，使培养基变黑。,方法：将待检细菌接种到七叶苷培养基上，培养后观察结果，培养基变黑色者为阳性，培养基不变色为阴性。,结 果,+,-,第四十一页，共六十八页。,二、蛋白
15、质和氨基酸的代谢(dixi),第三节 细菌生化鉴定(jindng)技术,原理：细菌产生色氨酸酶，分解培养基中色氨酸，生成靛基质（吲哚），靛基质与对二甲基氨基苯甲醛作用(zuyng)，生成玫瑰靛基质，是为靛基质试验阳性。,方法：将待检菌接种于蛋白胨水中，35培养1824h，取出后沿试管壁加入靛基质试剂数滴，在两液面观察结果。,结 果,1、靛基质（吲哚）试验,第四十二页，共六十八页。,二、蛋白质和氨基酸的代谢(dixi),第三节 细菌(xjn)生化鉴定技术,原理(yunl)：细菌产生酶，分解含硫氨基酸生成硫化氢，硫化氢与培养基中的亚铁盐或铅盐结合生成黑色化合物。,方法：将细菌穿刺接种到醋酸铅培养基
16、中，35、1824h，观察结果。,结果：黑色管为阳性,2、硫化氢试验,第四十三页，共六十八页。,二、蛋白质和氨基酸的代谢(dixi),第三节 细菌生化(shn hu)鉴定技术,原理：细菌(xjn)产生脲酶，水解尿素生成氨和二氧化碳，培养基呈碱性反应,方法：将待检菌接种于尿素培养基中，35培养1824h取出观察。,结 果,3、尿素酶试验,-+,第四十四页，共六十八页。,二、蛋白质和氨基酸的代谢(dixi),第三节 细菌生化(shn hu)鉴定技术,原理：细菌产生苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱氨形成(xngchng)苯丙酮酸，苯丙酮酸与三氯化铁作用，形成(xngchng)绿色化合物,方法：将待检菌接种于苯丙氨酸微量培养管中（接种量稍大），培养后在培养基上直接滴加10氯化铁试剂，出现绿色反应者为阳性。,结 果,4、苯丙氨酸脱氨酶试验,-+,第四十五页，共六十八页。,三、碳源利用(lyng)试验,第三节 细菌生化(shn hu)鉴定技术,原理：有的细菌能利用培养基中的枸橼酸盐作为唯一(wi y)的碳源，细菌在生长过程中分解枸橼酸盐产生碳酸盐，使培养基呈碱性反应,方法：将待检菌接种于枸橼酸盐培养基
