1、第四章细 胞 破 碎,1,第一页，共六十八页。,概述(i sh),不同类型的细胞分泌目标产物的类型：动物细胞多分泌到细胞外培养液植物细胞多为胞内产物微生物（细菌/酵母/真菌）胞内、胞外 对于(duy)胞内产物需要收集菌体或细胞进行破碎。,2,第二页，共六十八页。,概述(i sh),大多数情况下，抗生素，胞外酶，一些多糖，及氨基酸等目标产物存在于发酵液中。有些目标产物存在于生物体中。尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋白质是在细胞内沉积。脂类物质(wzh)和一些抗生素包含在生物体中。,3,第三页，共六十八页。,概 述,细胞破碎（cell rupture）技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内物
2、质包括目的产物成分释放出来的技术。细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质（产品）的基础。为了研究细胞破碎，提高(t go)其破碎率，有必要了解各种微生物细胞壁的组成和结构。,4,第四页，共六十八页。,1 细胞壁结构(jigu),微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞壁里面是细胞膜，动物细胞没有细胞壁，仅有细胞膜。通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。不同细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞壁的机械(jxi)强度不同，细胞破碎的难易程度也就不同。,5,第五页，共六十八页。,细菌(xjn)细胞壁结构,几乎所有细菌的细胞壁都是由肽聚糖组
3、成，它是难溶性的聚糖链；相邻聚糖链上的短肽又交叉相联，构成了细胞壁的三维网状结构，包围在细胞周围；使细胞具有(jyu)一定的形状和强度。,6,第六页，共六十八页。,细菌(xjn)细胞壁结构,破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构，其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存在的肽键(ti jin)的数量和其交联的程度。革兰氏阴性菌的细胞壁结构与革兰氏阳性菌有很大不同。革兰氏阴性菌典型的生物是大肠杆菌，通过这种细胞生产了很多细胞重组的产物。,7,第七页，共六十八页。,酵母(jiom)细胞壁的结构示意图,最里层是由葡聚糖的细纤维组成，它构成了细胞壁的刚性骨架，使细胞具有一定的形状，上面的是一层糖
4、蛋白，最外层是甘露聚糖，由1,6-磷酸二酯键连接成网状。在该层的内部，有甘露聚糖-酶的复合物。破碎酵母细胞壁的阻力主要决定于壁结构交联的紧密(jnm)程度和它的厚度。,8,第八页，共六十八页。,真菌(zhnjn)的细胞壁,真菌的细胞壁较厚，主要由多糖组成，其次还含有较少量的蛋白质和脂类。不同的真菌，细胞壁的组成有很大的不同，其中大多数真菌的多糖壁是由几丁质和葡聚糖构成，少数(shosh)含纤维素。与酵母和细菌的细胞壁一样，真菌细胞壁的强度和聚合物的网状结构有关，不仅如此，它还含有几丁质或纤维素的纤维状结构，所以强度有所提高。,9,第九页，共六十八页。,红面包霉菌细胞壁具有同心圆层状结构主要存在
5、(cnzi)三种聚合物最外层(a)是-和-葡聚糖的混合物，第2层(b)是糖蛋白的网状结构第3层(c)主要是蛋白质，最内层(d)主要是几丁质。,红面包霉菌(mjn)细胞壁的结构示意图,10,第十页，共六十八页。,细胞壁的组成(z chn)和结构,细胞壁的组成(z chn)和结构,11,第十一页，共六十八页。,植物(zhw)细胞壁的结构,对于已生长结束的植物细胞壁可分为初生壁和次生壁两部分。初生壁是细胞生长期形成的。初生壁一般较薄（13m），富有弹性。由多糖和蛋白质构成，多糖主要成分为纤维素、半纤维素和果胶类物质。纤维素是长链D-葡聚糖，许多这样的长链形成微纤丝。它是构成细胞壁的骨架，细胞壁的机械
6、(jxi)强度主要来自于微纤丝。,12,第十二页，共六十八页。,植物(zhw)次生细胞壁,某些植物细胞，当生长停止后，在细胞质和初生细胞壁之间形成了次生细胞壁。次生壁一般较厚(4m以上)，常有三层组成(z chn)。在次生壁中，纤维素和半纤维素含量比初生壁增加很多，纤维素的微纤丝排列得更紧密和有规则，而且存在木质素的沉积。因此次生壁的形成提高了细胞壁的坚硬性，使植物细胞具有很高的机械强度。,13,第十三页，共六十八页。,细胞破碎(p su)方法,表 4.1-1.细胞(xbo)化学破碎法,14,第十四页，共六十八页。,表 4.0-1.细胞机械(jxi)破碎法,15,第十五页，共六十八页。,2 C
7、HEMICAL METHODS 化学(huxu)方法,16,第十六页，共六十八页。,表4.1-1介绍了主要的几种化学方法，有渗透冲击法，表面活性剂增溶法、脂溶法。首先(shuxin)简单的介绍一下酶消化法和碱处理法。,17,第十七页，共六十八页。,酶消化法和碱处理法都是细胞破碎的有效方法(fngf)，但是也都有各自的缺点。,18,第十八页，共六十八页。,1 酶解（酶溶法 Enymatic lysis),酶解是利用(lyng)溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到破坏后，再利用(lyng)渗透压冲击等方法破坏细胞膜。1）外加酶法,19,第十九页，共六十八页。,外加(wiji)酶法,有时采用几种
8、酶的混合物会产生更好的效果，加入时需确定相应的次序。对酵母(jiom)细胞采用酶法破碎时，先加入蛋白酶作用蛋白质-甘露聚糖结构，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层，最后只剩下原生质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破裂，释出胞内产物。,20,第二十页，共六十八页。,外加(wiji)酶法,酶解法的特点是专一性强，因此在选择酶系统时，必须根据细胞的结构和化学组成来选择。溶菌酶（lysozyme)能专一性地分解细胞壁上肽聚糖分子的-1,4糖苷键，因此主要用于细菌类细胞壁的裂解。革兰氏阳性菌悬浮液中加入溶菌酶，很快就产生溶壁现象。但对于革兰氏阴性菌，单独采用溶菌酶无效果，必须与螯合剂ED
9、TA一起使用。放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌，以肽聚糖为主要成分，所以也能采用溶菌酶，酵母和真菌由于(yuy)细胞壁的组分主要是纤维素、葡聚糖、几丁质等，常用蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶等。植物细胞壁的主要成分是纤维素，常采用纤维素酶和半纤维素酶裂解。,21,第二十一页，共六十八页。,酶解法(ji f)的特点,优点：发生酶解的条件温和(wnh)能选择性地释放产物胞内核酸等泄出量少，细胞外形较完整,缺点：溶酶价格高，溶酶法通用性差（不同(b tn)菌种需选择不同(b tn)的酶)产物抑制的存在。,22,第二十二页，共六十八页。,碱处理法和酶消化(xiohu)法相反，反应激烈，不具选择性，而且较
10、便宜。碱加入细胞悬浮液中后和细胞壁进行了多种反应，包括使磷脂皂化。,23,第二十三页，共六十八页。,碱能溶解细胞壁上脂类物质或使某些组分从细胞内渗漏出来(ch li)。成本低，反应激烈，不具选择性。,碱处理(chl)法,24,第二十四页，共六十八页。,1）渗透压冲击(chngj)法,渗透压冲击是较温和的一种(y zhn)破碎方法，将细胞放在高渗透压的溶液中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），由于渗透压的作用，细胞内水分便向外渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀释，或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，胞外的水迅速渗入胞内，引起细胞快速膨胀而破裂。仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞
11、壁预先用酶处理或在培养过程中加入某些抑制剂（如抗生素等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。,25,第二十五页，共六十八页。,渗透流的动力来自渗透压，渗透压可能很大。可以(ky)通过化学平衡来估算，水的化学电势是常数，即：H20(outside)=H20(inside)(4.3-1),26,第二十六页，共六十八页。,细胞外纯水的化学电势包括标准化学电势和压力修正项；与之平衡的胞内的化学电势包括三项，即标准化学电势、压力修正相和浓度修正项。对于理想(lxing)的不可压缩溶液，这些修正相和式（4.2-1）可改写为：0 H20+VH2oPout=0 H20+VH2oPin+RT ln(1-x1)(4.3-
12、2),27,第二十七页，共六十八页。,0H20标准化学电势 VH2o水的偏摩尔体积 x1细胞内所有溶质的总摩尔(m r)分数 若包内物为稀溶液，其偏摩尔体积等于纯水的摩尔体积。且x1很小时就有：,28,第二十八页，共六十八页。,Pout-Pin=(RT/-VH2o)ln(1-x1)=(RT/-VH2o)(-x1-)=-RTc1+(4.3-3)该式称为(chn wi)范特苛夫定律。,29,第二十九页，共六十八页。,由该方程知细胞内压力必须(bx)小于细胞外压力，否者，水会流入细胞内，溶破细胞。我们可以采用等式4.2-3 估算出渗透压的大小。许多细胞内溶质浓度大约为0.1M NaCl 或0.2M溶
13、质。由此可见渗透压必须很大，才导致了细胞的破碎。,30,第三十页，共六十八页。,通用性差；时间长，效率(xio l)低，一般胞内物质释放率不超过50%.,化学(huxu)渗透法特点：,缺点(qudin),对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内；细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。,优点,31,第三十一页，共六十八页。,2）、增溶法,第二种是利用表面(biomin)活性剂的增溶法。最典型的是将体积为细胞体积两倍的某浓度的表面(biomin)活性剂加入到细胞中。表面(biomin)活性剂能将细胞壁破碎
14、，制成的悬浮液可用离心分离除去细胞碎片，再用吸附柱或萃取剂分离制得产品。,32,第三十二页，共六十八页。,细胞破碎常用的表面(biomin)活性剂：十二烷基硫酸钠（SDS，阴离子型）；。非离子型如Triton X-100和吐温（Tween）等对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双分子层，使某些胞内物质释放出来。,无论表面活性剂是阴离子、阳离子还是非离子型，都是两性的，既能和水作用也能和脂作用，能与细胞壁上的脂蛋白结合，形成(xngchng)微泡，使膜的通透性增加或溶解,33,第三十三页，共六十八页。,方法有效在于表面活性剂的化学性质，化学性质由图4.3-1所示的化学结
15、构表示(biosh)。结构中有一个亲水基团，通常是离子；一个疏水基团，通常是烃基。表面活性剂通常是两性的，既能和水作用也能和脂作用。,34,第三十四页，共六十八页。,35,第三十五页，共六十八页。,无论表面活性剂是阴离子、阳离子还是非离子型，都是两性的。SDS（十二烷基(wn j)磺酸钠）是典型的阴离子表面活性剂。阴离子表面活性剂还包括肥皂（脂肪酸盐）。,36,第三十六页，共六十八页。,由于肥皂的增溶作用依赖于羧基，因此只有(zhyu)在PH 值较高，羧基解离的情况下，肥皂才是有效的表面活性剂。在硬水中，由于Ca2+与羧酸基团形成不可溶的沉淀，而使肥皂失效。,37,第三十七页，共六十八页。,可
16、通过将肥皂的羧基用硫酸盐代替来改变传统肥皂的缺点。硫酸盐代替的肥皂是目前洗衣店常用(chn yn)及超市中常见的表面活性剂。硫酸盐可连在苯环上，结构如图4.2-1所示。这种硫酸盐表面活性剂比碱对细胞破碎的作用更好，磺酸盐不易被微生物降解，所以洗衣店中并不常用(chn yn)。,38,第三十八页，共六十八页。,阳离子表面活性剂主要(zhyo)是烷基胺盐。图4.3-1中的十二烷基溴胺是典型的例子。它有一个长烷烃链（十六烷基）和三个甲基，都连接在一个带正电的氮原子上，负离子通常是卤素，市场上常做洗发剂出售。细胞破碎时条件较温和。,39,第三十九页，共六十八页。,非离子表面活性剂是溶于水的聚合物。经济价值不明确，市场(shchng)上用于做洗碗剂。同样，这种清洁剂既有亲水基团又有疏水基团。亲水基团不是硫酸盐，不是烷基胺盐而是乙醇。,40,第四十页，共六十八页。,这类表面活性剂起作用在于能溶解细胞壁中的脂，进行细胞破碎。图4.3-2表示了该表面活性增溶的原理。在高度稀释洗涤剂中，脂会溶解在溶液中；超过这个浓度溶解的物质的量与浓度成正比。还有，表面活性剂的表面张力是常数，表面活性的选择电极可以(k
