1、第四章 动物(dngw)干细胞,第一节 干细胞的概念(ginin)和分类一、概念,干细胞（Stem cell）是一类具有自我更新(gngxn)和分化潜能的细胞,能产生表型和基因型与自己完全相同的子细胞，并具有不同分化潜能。,胚胎干细胞,第一页，共七十四页。,形态特征：圆形或椭圆形，体积小，核质比大；生化特征：较高的端粒酶活性；一般都有独特的表 面标志；增殖特征:自稳定性：单细胞或无脊椎动物(jzhudngw)不对称分裂 哺乳动物种群意义上的不对称分裂分化特征：是干细胞最重要的特征。干细胞本生不 是终末分化细胞，具有再分化的潜力。,干细胞的主要生理(shngl)特征：,第二页，共七十四页。,第三
2、页，共七十四页。,二、分类(fn li)一）根据发生来源分类胚胎干细胞：成体干细胞：,来自早期胚胎(piti)（ESC）、原始生殖细胞（PGC）、或畸胎瘤组织（EC）等,如骨髓造血(zo xu)干细胞（HSC），间质干细胞（MSC），神经干细胞（NSC）,第四页，共七十四页。,ESC,第五页，共七十四页。,什么(shn me)是畸胎瘤,如果在胚胎不同时期，某些多能细胞从整体上分离或脱落下来，使细胞基因发生突变，分化异常，则可发生胚胎异常。一般认为，这种分离或脱落发生于胚胎早 期，则形成畸胎；而如发生于胚胎后期，则形成了具有内胚层(picng)、中胚层(picng)和外胚层(picng)三个胚层
3、(picng)的异常分化组织，即形成了畸胎瘤。,第六页，共七十四页。,鼻咽畸胎瘤,淋巴管瘤,第七页，共七十四页。,生殖(shngzh)嵴与PGC（原始生殖(shngzh)细胞）,第八页，共七十四页。,第九页，共七十四页。,成体干细胞：神经(shnjng)干细胞,第十页，共七十四页。,二）根据分化潜能分类全能(qunnng)干细胞：如ESC多能干细胞：如造血干细胞、间充质干细胞定向祖细胞：如造血母细胞等。专能干细胞：皮肤干细胞，成肌细胞等,第十一页，共七十四页。,第十二页，共七十四页。,第十三页，共七十四页。,三）根据干细胞存在的组织器官分类胚胎干细胞造血干细胞神经(shnjng)干细胞肝脏干细
4、胞皮肤干细胞肌肉干细胞等,第十四页，共七十四页。,第二节 胚胎(piti)干细胞,通过建立体外培养的方法，获得保持增殖(zngzh)且不分化的胚胎干细胞系的技术称为胚胎干细胞的建系。一、胚胎来源的干细胞系（p132 图6-1）1.囊胚阶段的内细胞团（ICM）2.来源于生殖嵴部位的原始生殖细胞（PGC）3.来源于畸胎瘤组织（EC）,第十五页，共七十四页。,二、胚胎(piti)干细胞的建系,主要步骤包括：1.培养(piyng)体系的选择和准备2.胚胎采集3.ICM的获取4.ICM的离散5.ESC的建系,第十六页，共七十四页。,1.培养(piyng)体系的选择和准备,饲养层细胞的准备：饲养层细胞一方
5、面对ESC细胞帖壁起支持作用，另一方面其分泌蛋白可抑制ESC分化，维持其增殖(zngzh)特性和多能性。常用饲养层细胞为成纤维细胞（如STO成纤维细胞系）、子宫内皮细胞、3T3细胞株等。为了阻断饲养层细胞的分裂，而不影响其分泌蛋白的产生，通常采用射线或丝裂霉素C处理之。,第十七页，共七十四页。,培养基的准备：用DMEM（高糖）培养液，其中胎牛血清的浓度和质量很重要，还要加非必须(bx)氨基酸；-巯基乙醇。常采用添加LIF等抑制ESC的分化潜能；添加EGF等生长因子来促进ESC的增殖。,第十八页，共七十四页。,LIF抑止(yzh)胚胎干细胞分化的信号通路,LIF 干细胞表面的LIF受体和gp13
6、0蛋白形成异二聚体 激活JAK酪氨酸激酶系统 激活MAP激酶ERK级联反应和STAT3蛋白 STAT3形成同型二聚体入核 激活核内靶基因转录 表达(biod)相应蛋白抑止ESC的分化,第十九页，共七十四页。,2.胚胎的采集一般囊胚期胚胎或后桑葚胚。3.ICM的获取1）直接分离法：囊胚于饲养层上自行(zxng)发育成孵化囊胚，待ICM扩大增殖时挑取。或使用链霉蛋白酶处理ZP，获得裸胚培养。2）免疫分离法：链霉蛋白酶去除囊胚晚期胚泡ZP，依次转移至补体灭活和未灭活的抗血清中，去除滋胚层细胞后，吸取ICM，移至饲养层培养。,第二十页，共七十四页。,4.ICM的离散(lsn)胰蛋白酶消化即可离散ICM
7、。5.胚胎干细胞建系,第二十一页，共七十四页。,三、胚胎(piti)干细胞的应用,第二十二页，共七十四页。,第二十三页，共七十四页。,第二十四页，共七十四页。,第三节、胚胎(piti)干细胞的生物学特性与鉴定方法,一、生物学特性增殖与分化特征：永生化(immortal)；能维持稳定的正常的二倍体染色体结构；有稳定的发育潜能，能被诱导(yudo)增殖或分化；能参与胎儿所有组织的发育过程；,第二十五页，共七十四页。,形态特征(tzhng)体积小、核大，有一个或多个核仁；胚胎干细胞克隆紧密堆积，细胞之间无明显的界限，细胞克隆有一定形状规律。生化特征具有碱性磷酸酶和端粒酶活性；表达SSEA-3、SSE
8、A-4、TRA-1-60等表面标志；表达OCT-4蛋白；,第二十六页，共七十四页。,第二十七页，共七十四页。,人胚胎干细胞的表面(biomin)标志,第二十八页，共七十四页。,Otc4基因(jyn),Otc4基因被认为在整个卵子生成和囊胚附殖前以及早期外胚层中都表达，是受精卵全能性的关键。Otc4基因只能在胚胎中才能得到完全表达，而在成体(chn t)动物体细胞中的表达基本上被关闭。这就意味着克隆人技术的第一步就存在很大问题。所以Otc4也被称为克隆人终结者。,第二十九页，共七十四页。,二、胚胎干细胞的鉴定(jindng)方法,1.形态(xngti)鉴定：核质比大，体积小，细胞集落小鼠呈鸟巢状
9、，牛、猪等呈馒头状，人呈扁平、松散聚合体。2.核型分析：二倍体核型，染色体受损情况等。,第三十页，共七十四页。,3.ESC特异性表面抗原表达的鉴定：小鼠ESC以SSEA-1为主，人以SSEA-3、SSEA-4为主。此外，ALP、Otc-4等都可作为表面标志。4.端粒酶活性鉴定：端粒长度及端粒酶活性检测。5.体内外分化能力(nngl)鉴定：体内外分化能力鉴定：胚胎小体（EB，或称拟胚体）,第三十一页，共七十四页。,改变细胞的培养条件:改变细胞的培养条件是ES细胞定向分化的基本策略,常用的方法有:与辅助细胞共培养;在半固体培养基中原位生长分化;添加生长因子、化学诱导剂等。导入外源性基因(jyn),
10、使其分化为某一特定类型的细胞。体内定向分化,使ES 细胞多数分化为该组织特异性的细胞。,三、胚胎干细胞定向诱导分化(fnhu)的方法,第三十二页，共七十四页。,胚胎干细胞的诱导分化：胎牛血清，骨髓基质细胞共培养胚胎干细胞造血细胞 RA胚胎干细胞神经细胞 DMSO胚胎干细胞肌肉(jru)细胞 TGF-B1,VEGF,bFGF胚胎干细胞血管和内皮细胞 RA+胰岛素+T3胚胎干细胞脂肪细胞 BMP-2,BMP-4胚胎干细胞软骨细胞 地塞米松，磷酸甘油胚胎干细胞骨细胞 基因转染胚胎干细胞胰岛素分泌细胞,第三十三页，共七十四页。,第三十四页，共七十四页。,人胚胎(piti)干细胞注射至免疫缺陷小鼠的后腿
11、肌肉中形成的各种组织：（a）肠样结构；(b)神经上皮花结；(c）骨骼；(d)软骨；(e)横纹肌；(f)肾。,第三十五页，共七十四页。,A.小鼠成纤维饲养细胞上培养8天后的ICM（标尺100um）B.ICM中分离出的H9细胞系（标尺100um）C.H9细胞系（标尺50um）D.在无小鼠胚胎成纤维细胞，但有LIF（20ng/ml）的条件(tiojin)下培养5d后，H9细胞发生分化（标尺100um）,第三十六页，共七十四页。,第四节、成体干细胞,一、概念和生物学特征概念：指一群分布在成体组织中尚未分化的、具有自我更新、并负有构建和补充某种组织的各种类型细胞(xbo)潜能的干细胞(xbo)。生物学特
12、征：1、慢周期性2、自我更新和再生能力的有限性3、不对称分裂4、细胞鉴定标志,第三十七页，共七十四页。,造血干细胞是体内各种血细胞的唯一来源，它主要存在于骨髓、外周血、脐带血中。造血干细胞的移植是治疗血液系统疾病、先天性遗传疾病以及多发性转移性肿瘤疾病的最有效方法。与骨髓移植和外周血干细胞移植相比，脐血干细胞移植的长处在于无来源的限制，对HLA配型要求不高，不易(b y)受病毒或肿瘤的污染。,造血(zo xu)干细胞,第三十八页，共七十四页。,造血(zo xu)干细胞的来源,骨髓；1/400外周血；1/100000脐带血；1/10000胎儿造血系统(xtng)；胚胎干细胞和胚胎生殖细胞。,第三
13、十九页，共七十四页。,二、成体干细胞的分离与鉴定（以HSC为例）无菌采集骨髓 低渗处理 密度梯度离 心 获单核细胞 CD34抗体标记(bioj)流式细胞仪分离结合免疫吸附分离 鉴定。,第四十页，共七十四页。,Culturing Hematopoietic Stem Cell,第四十一页，共七十四页。,造血(zo xu)干细胞的体外培养,第四十二页，共七十四页。,如造血(zo xu)干细胞的鉴定：,细胞形态：集落呈非贴壁生长，细胞形态较小细胞表面标志：flk-1（Fetal Liver Kinase 1);L/TAL-1；CD34；GATA-1；基因表达：TAL-1；GATA-2；H1；主要珠蛋
14、白 体外移植：浆细胞移植给患者(hunzh)能恢复造血功能，并且二次移植仍可重建造血系统。,第四十三页，共七十四页。,造血(zo xu)干细胞的移植,移植前处理(chl):超大剂量的放疗、化疗尽量消灭肿瘤细胞，同时抑制患者的免疫系统，使供体者的造血干细胞可以顺利植入。采集供体者的造血干细胞（骨髓、外周血、脐带血），并与受体进行HLA配型；将造血干细胞输入到受体者体内，造血干细胞会自动定居到脊髓。,第四十四页，共七十四页。,三、成体干细胞(xbo)的应用：细胞(xbo)移植技术,细胞类型 治疗的疾病神经细胞 中风(zhng fng)、帕金森氏病、老年痴呆症、脊髓损伤、多发性硬化病心肌细胞 心脏病
15、发作、充血性心脏病产生胰岛素的细胞 糖尿病软骨细胞 骨性关节炎血细胞 癌症、免疫缺乏症、遗传学血液 病、白血病肝细胞肝炎、肝硬化皮肤细胞烧伤骨细胞骨质疏松症视网(眼)细胞黄斑症骨骼肌细胞 肌肉萎缩症,第四十五页，共七十四页。,第四十六页，共七十四页。,作业题,1、什么是干细胞？如何分类？2、干细胞有什么生物学特性？3、简述来源于ICM的胚胎干细胞分离方法。4、ESC培养时常用的饲养层细胞(xbo)有哪些？其作用是是什么？5、什么是成体干细胞？有哪些种类？,第四十七页，共七十四页。,补充知识(zh shi)：组织工程,.组织工程的概念应用工程学和生命科学的原理和方法，研究细胞、组织诱导因子和生物
16、(shngw)材料间相互作用的关系，研制生物(shngw)性替代物用以修复或重建组织器官的结构，维持、恢复和改善病损组织或器官的功能。,第四十八页，共七十四页。,1993年Langer及Vacanti兩位學者在著名的”Science”學術期刊上提出組織工程(gngchng)(tissue engineering)的構想，隨後根據此構想將軟骨細胞培養於人耳形狀的生醫材料上，再植入老鼠背部(上圖)，形成具有耳朵外觀的組織，此一前瞻性技術成為組織工程研究的先驅。,第四十九页，共七十四页。,2.组织(zzh)工程的方法,活体(hu t)组织细胞分离 与胞外基质分子混合 细胞体外培养扩增形成组织 移植到体内,第五十页，共七十四页。,.组织工程(gngchng)的三要素细胞、支架、信号,第五十一页，共七十四页。,（1）种子(zhng zi)细胞,细胞必须能不断进行细胞分裂，且必须能被调控分化成特定的组织细胞 干细胞：胚胎干细胞、成体干细胞(如MSC)组织(zzh)来源细胞：自体或异体组织(zzh)细胞,Growth factor stimulation,第五十二页，共七十四页。,（2）组织生长支架
