1、红细胞计数、红细胞形态(xngti)检查、血红蛋白测定,检验(jinyn)系临检教研室 陈丽华,第一页，共九十三页。,目的(md)要求,1.掌握：红细胞计数、氰化高铁血红蛋白测定的原理、方法、质量控制、参考值、方法学平价及临床意义；红细胞形态(xngti)。2.了解：血红蛋白测定其他方法。,第二页，共九十三页。,重点:红细胞计数、血红蛋白测定的原理(yunl)、血片 红细胞形态、难点:红细胞检验的形态、质控。,目的(md)要求,第三页，共九十三页。,一、概 述,第四页，共九十三页。,1.红细胞的生成(shn chn),骨髓(su)造血干细胞-红系祖细胞-原红细胞-早幼-中幼-晚幼-网织红细胞-
2、成熟红细胞,Epo,每个原红细胞可以(ky)生成16个红细胞。,48h,无分裂能力,第五页，共九十三页。,2.红细胞的破坏(phui),健康人红细胞平均寿命120天。红细胞主要因衰老而消亡，破坏主要在单核-巨噬细胞系统(xtng)，器官主要是在脾脏和肝脏；其次为骨髓和其他部位。,第六页，共九十三页。,二、红细胞计数(j sh),第七页，共九十三页。,红细胞计数（red blood cell count,RBC）即测定单位体积内红细胞数量(shling)。是血液一般检验的基本项目，常作为诊断贫血和红细胞增多的主要指标之一。,测定方法,显微镜计数法,血液(xuy)分析仪法,第八页，共九十三页。,（
3、一）显微镜计数法,【检测原理】采用(ciyng)等渗稀释液将血标本稀释一定倍数，滴入血细胞计数室中，显微镜下计数一定区域内红细胞数，经换算得每升血液中红细胞数量。,第九页，共九十三页。,【器材】微量吸管，采血针，小试管，计数(j sh)板，盖片，棉球，显微镜。【试剂】红细胞稀释液：任选一种1.Hayem稀释液：氯化钠1.0g、硫酸钠（含10个结晶水）5.0g，氯化高汞0.5g，蒸馏水加至200mL，过滤后使用。氯化钠-调节渗透浓度 硫酸钠-提高比重防止红细胞粘连 氯化高汞-防腐剂，有毒,第十页，共九十三页。,2.柠檬酸盐甲醛(ji qun)盐水氯化钠 0.6g 调节渗透压柠檬酸钠 1.0g 调
4、节渗透压，抗凝36%甲醛 1ml 防腐蒸馏水加至100ml，过滤2次后使用。3.生理盐水或加1%甲醛的生理盐水,第十一页，共九十三页。,【操作】1.中号试管（15100mm）加等渗稀释液2ml；2.毛细血管采末梢血10l加入(jir)上述稀释液，立即摇匀（稀释200倍）；3.充池，静置2min后以低倍镜计数中间大方格内四角和中央5个中方格内的红细胞数。,未染色(rns)红细胞呈双凹盘形，有黄绿色折光。,第十二页，共九十三页。,红细胞计数(j sh),2ml稀释液 充分混匀 10ul血液 充池、静止(jngzh)镜下计数,第十三页，共九十三页。,3mm WBC WBC WBC WBC 1mm,第
5、十四页，共九十三页。,红细胞数/L=5个中方格(fn)内红细胞5 10 200 106/L 或=1012/L,5个中方格(fn)内红细胞数,100,【报告(bogo)方式】,【计算】,RBC（/L）=.1012/L,第十五页，共九十三页。,【方法学评价】1手工显微镜法 2血液分析仪法 为目前主要临床检验(jinyn)细胞计数方法变异系数（coefficient of variation,CV）小。,第十六页，共九十三页。,【质量控制】1手工法 误差来源包括(boku)：标本、操作、器材、固有误差（计数域误差）2仪器法 严格按操作规程；定期作室内和室间质控。,第十七页，共九十三页。,【参考值】男
6、性(nnxng):（4.00-5.50）1012/L 女性:（3.50-5.00）1012/L新生儿:（6.00-7.00）1012/L,【校正】WBC100109/L时，需校正：实际红细胞/L=所数细胞总数白细胞数（正常(zhngchng)红细胞：白细胞=750：1,可忽略白细胞的影响）,第十八页，共九十三页。,【注意事项】1.采血及摇匀迅速，防止血液凝固；2.器械应防酸防碱且干燥(gnzo)；3.充池要摇匀；4.计数时，应识别酵母及白细胞。,第十九页，共九十三页。,三、血红蛋白(xuhng dnbi)测定,第二十页，共九十三页。,（一）血红蛋白(xuhng dnbi)的结构,血红蛋白结构(
7、jigu)：由珠蛋白和亚铁血红素结合组成。,第二十一页，共九十三页。,空间结构：每个血红蛋白有4条珠蛋白肽链，每条肽链包裹(bogu)1个亚铁血红素，形成具有四级空间结构的四聚体。,第二十二页，共九十三页。,【分类】（每个珠蛋白分子含两条 链和两条非 链）正常人：HbA（22）占90%成人主要血红蛋白；HbA2（22）占2%-3%成人次要(cyo)血红蛋白 HbF（22）占2%以下 胎儿主要血红蛋白,第二十三页，共九十三页。,生理情况(qngkung)下，99%Hb的铁呈Fe2+状态，称为还原血红蛋白，亚铁状态的Hb与氧结合称氧合血红蛋白（HbO2).1%Hb的铁呈Fe3+状态，称为高铁血红蛋
8、白（Hi）。,Hb的合成(hchng)受激素的调节：Epo和雄激素。,第二十四页，共九十三页。,注意事项：1.如-链或-链合成障碍，使三种正常血红蛋白比例异常(ychng)，即各型地中海贫血；如多肽链发生氨基酸置换、丢失、加长，称为血红蛋白病。2.病理情况下可出现硫化血红蛋白（SHb）。,第二十五页，共九十三页。,（二）血红蛋白(xuhng dnbi)衍生物及其吸收光谱,1.氧合血红蛋白（oxyhemoglobin,HbO2）:Hb与O2结合时形成。2.还原(hun yun)血红蛋白（reduced hemoglobin,Hbred）：未与O2结合时的Hb。3.高铁血红蛋白（hemiglo-b
9、in,Hi）或正铁血红蛋白（methemoglobin,Mhb）:Fe 2+被氧化成Fe 3+。,第二十六页，共九十三页。,4.碳氧血红蛋白（HbCO）、硫化血红蛋白（SHb）：与O2结合的配位键被CO、S等占据。5.氰化高铁血红蛋白（HiCN）：Hi与CN-结合而成。波峰(bfng)540nm，波谷504nm。,正常情况下，血液(xuy)中血红蛋白主要是HbO2和Hbred，以及少量HbCO和Hi。,第二十七页，共九十三页。,（三）血红蛋白(xuhng dnbi)测定方法,手工(shugng)法：,HiCN法,SLS-Hb法,AHD575法,HiN3法,血液(xuy)分析仪法,第二十八页，共
10、九十三页。,1、氰化高铁血红蛋白(xuhng dnbi)（HiCN）测定法,1）原理：在Hb转化液中，除SHb外，Hb被高铁氰化钾氧化成高铁血红蛋白(xuhng dnbi)，再与CN-结合，生成稳定的棕红色氰化高铁血红蛋白（HiCN），吸收峰为540nm，毫摩尔消光系数为44 Lmmol-1 cm-1。因此根据标本的吸光度，即可求得血红蛋白总量（不含SHb）。,第二十九页，共九十三页。,2）器材：分光光度计、移液管、微量吸管、试管等。3）试剂：血红蛋白转化液（文齐液）成分如下高铁氰化钾：使Hb转化成Hi氰化钾：使Hi形成(xngchng)HiCN无水磷酸二氢钾：防止混浊，调节pH值Triton
11、X100:非离子型表面活性剂，加速溶血，缩短转化时间，防止因血浆蛋白改变引起的混浊。,第三十页，共九十三页。,4）操作：a.取指血20ul，加到5ml血红蛋白转化液中，混匀，静置5分钟。b.用分光(fn un)光度计比色。波长540nm，以空白转化液调零，测定吸光度“A”。,第三十一页，共九十三页。,5）计算标准状态下的计算Hb（g/L）=A 251A 367.7其中，A为测得的吸光度，64458为Hb的分子量，251为测定(cdng)时血液稀释倍数，44为HiCN的毫摩尔吸光系数，1000为换算成摩尔吸光系数。,64458,441000,第三十二页，共九十三页。,非标准状态下的计算：求换算常
12、数(chngsh)K 标准液标定Hb液浓度(标准值)K=-本室测定标准液的“A”(测定值)标本Hb g/L=标本测定值A,第三十三页，共九十三页。,举例：用不同浓度(nngd)的Hb的标准品：50，100，150，200g/L测得的吸光度分别为0.13,0.27,0.41和0.54。则K值为K=371.75若测定管吸光度为0.32，则测定管Hb浓度为Hb（g/L）=0.32371.75=118.96,Hb,A,50+100+150+200,0.13+0.27+0.41+0.54,第三十四页，共九十三页。,6)结果报告(bogo)Hb g/L7)参考值成年男性：120-160 g/L 成年女性：
13、110-150 g/L新生儿：170-200 g/L,第三十五页，共九十三页。,贫血分级：轻度：男性120g/L,女性110g/L 中度(zhn d)：90g/L 重点：60g/L 极重度：30g/L,第三十六页，共九十三页。,8）质量保证废弃物：KCN为剧毒药品，要小心对待，实验完后要用次氯酸钠溶液处理后才能(cinng)弃倒。b.器材及试剂：血红蛋白转化液不能贮存在塑料瓶中，否则CN-下降使结果偏低。c.标本：下列因素可引起Hb假性增高：脂血症、血液浓缩、白细胞30109/L，重症黄疸，严重的血管内溶血等。,第三十七页，共九十三页。,2、方法学评价(pngji),1）HiCN法：由国际血液
14、学标准化委员会（ICSH）推荐，并经WHO确认为血红蛋白测定(cdng)的参考方法。优点：操作简单，结果稳定可靠，试剂容易保存 能测定除SHb以外的所有血红蛋白，并易 于建立质控。,第三十八页，共九十三页。,缺点(qudin)：不能测定SHb。对HbCO转化太慢，需要100分钟。高丙种球蛋白血症，变性Hb血症，高白细胞的血可出现混浊，按15g/L（pH7.27.5）甚至50g/L（pH6.76.9）加入氯化钠可防止，高浓度有核RBC引起的混浊不能防止。KCN为剧毒，需妥善保存。,第三十九页，共九十三页。,2)SDS-Hb（十二(sh r)烷基硫酸钠）法,优点：试剂无毒，结果(ji gu)准确，
15、重复性好缺点：SDS纯度难保证；依赖HiCN法，间接得到结果；试剂可破坏WBC，不能与WBC同时共用标本进行血细胞计数的自动分析。,第四十页，共九十三页。,3）叠氮高铁血红蛋白(xuhng dnbi)法（HiN3）,优点：准确度、精密度较高缺点：试剂(shj)仍有毒性，HbCO转化慢本法与HiCN法相似,第四十一页，共九十三页。,4）碱羟血红蛋白(xuhng dnbi)法（AHD575）,优点：试剂简易，不含毒性，呈色稳定，准确性与精确性较高。缺点(qudin):波峰位于575nm处，溶液中碱性较高，不适用于自动检测，HbF不能转化。,第四十二页，共九十三页。,5）CTAB法,优点：溶血性强且
16、不破坏白细胞，适于血液(xuy)分析仪检测。缺点：精密度、准确度略低。,沙利法为传统血红蛋白(xuhng dnbi)测定法，已淘汰。,第四十三页，共九十三页。,6）血液(xuy)分析仪法,优点：简便、快速、多项。缺点：仪器型号(xngho)不同，使用的溶血剂不同，形成的Hb衍生物不同。某些溶血剂形成的Hb衍生物稳定性较差，因此要严格控制溶血剂的量及作用时间。,第四十四页，共九十三页。,对具有抗溶血剂作用的疾病（肝病、低色素性贫血），溶血不完全而影响结果。有些溶血剂内虽加入(jir)了KCN，但其衍生物并非HiCN，而是氰化血红蛋白，仪器需经过HiCN标准液校正后，才能进行Hb测定。,第四十五页，共九十三页。,（四）Hb与RBC测定(cdng)的临床意义,参考值 RBC Hb男性(nnxng)（4.05.5）1012/L 120160g/L女性（3.55.0）1012/L 110150g/L新生儿（6.07.0）1012/L 170200g/L70岁男性 94.2122.2g/L70岁女性 86.5111.8g/L,第四十六页，共九十三页。,（1）生理(shngl)变化,1）年龄与性别新
