1、胰蛋白酶的脱盐及精制(jngzh)方法,组员(z yun)：白佳幸 张 鑫 江茹兰、梁美芳,1,第一页，共十七页。,基本(jbn)简介,脱盐精制(jngzh),提取(tq)操作,2,第二页，共十七页。,一、胰蛋白酶(y dn bi mi)简介,胰蛋白酶系自牛、羊或猪胰中提取的一种蛋白水解酶，这种肽链内切酶，只断裂(dun li)赖氨酸或精氨酸的羧基参与形成的肽键。白色或米黄色结晶性粉末，溶于水，不溶于乙醇、甘油、氯仿和乙醚。分子量为24 000，最适pH值7.88.5左右，当pH9.0时不可逆失活。Ca2+对酶活性有稳定作用；重金属离子、有机磷化合物、DFP、天然胰蛋白酶抑制剂对其活性有强烈抑
2、制。,3,第三页，共十七页。,作用(zuyng)用途,本品为蛋白质水解酶，能选择地水解蛋白质中由赖氨酸或精氨酸的羧基所构成的肽链，能消化溶解变性蛋白质，对未变性的蛋白质无作用，因此，能使脓痰液、血凝块等分解、变稀，易于引流排除，加速创面净化，促进肉芽组织新生，此外还有抗炎症作用。临床上用于脓胸、血胸、外科炎症、溃疡、创伤性损伤、瘘管等所产生的局部水肿、血肿及脓肿等。喷雾吸入，用于呼吸道疾病。也可用于治疗毒蛇咬伤。还常用于动物(dngw)细胞培养前对组织的处理。工业上用于皮革制造、生丝处理、食品加工等。,4,第四页，共十七页。,二、提取(tq)操作分离原理,在动物胰脏中除了存在胰蛋白酶外，还有另
3、外两种与胰蛋白酶性质相似的蛋白水解酶：胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶。在胰蛋白酶提取过程中，三者彼此很难分开。需采用合适的方法进一步分离纯化。从动物胰脏中提取胰蛋白酶，一般是用稀酸将胰腺细胞中含有的胰蛋白酶原提取出来(ch li)，然后根据等电点沉淀的原理将提取液的pH值调至酸性（pH3.0左右），使大量的酸性蛋白沉淀出来(ch li)。沉淀物经水溶解并调至pH8.0，用极少量的胰蛋白酶将胰蛋白酶原激活，同时溶液中的胰凝乳蛋白酶原和弹性蛋白酶原也被激活，三种酶原相互作用过程如下：,5,第五页，共十七页。,也可采用从胰脏中提取出胰蛋白酶原，利用合适的提取溶液的pH值促使胰蛋白酶原部分自溶，并通过溶液中
4、Ca2+的环境，使胰蛋白酶原被开始自溶的少量具有活性的胰蛋白酶所激活，转变为具有活性的胰蛋白酶（胰凝乳蛋白酶原及弹性蛋白酶原亦同时被胰蛋白酶激活成有活性的酶）。激活后的酶溶液再进一步分离(fnl)纯化。,6,第六页，共十七页。,试剂(shj)和器材,1、试剂（1）pH2.53.0乙酸化的水溶液（2）10%（积分数）乙酸（3）2mol/L硫酸（4）固体硫酸铵（5）无水CaCl2（6）结晶胰蛋白酶(y dn bi mi)（7）25%乙醇溶液(含 0.015mol/HCl、0.05mol/CaCl2)（8）95%乙醇（9）5mol/NaOH（10）丙酮,7,第七页，共十七页。,2、器材（1）胰脏（2
5、）组织捣碎机（3）离心机（4）磁力搅拌器（5）透析袋、20目筛网、纱布、水浴锅（6）烧杯、量筒、刻度吸管、试管、玻璃(b l)漏斗（7）布氏漏斗、抽滤瓶、温度计、滴管、玻璃搅棒、纱布、pH试纸等,8,第八页，共十七页。,方法(fngf)和步骤,方法(fngf)一 1、胰蛋白酶原的提取 取新鲜猪胰脏约150g，剥去结缔组织和脂肪，取净重100g，切成碎块，在组织捣碎机中捣碎，并加入2倍体积预冷的pH2.53.0 乙酸化水溶液，制成匀浆。浆液倒入500mL烧杯中，用10%（体积分数）乙酸调节pH在2.53.0之间，在510下提取6h以上，并间隙轻轻搅拌。用4层纱布过滤，尽量挤出滤液。组织残渣中再加
6、入0.5倍体积（约50mL左右）预冷的pH2.53.0乙酸化水溶液再提取一次（放置12h），再用4层纱布过滤。合并两次滤液，用2.5mol/L硫酸调节滤液pH在2.53.0之间，4放置4h（pH始终保持在2.53.0），使提取液中酸性蛋白沉淀析出。提取液用折叠滤纸于玻璃漏斗中自然过滤，收集滤液，量取体积（约200mL左右）。滤液中加入粉末状固体硫酸铵，使溶液达 0.75饱和度（每升滤液加492g，5）。放置过夜，使胰蛋白酶原完全析出。次日抽滤，弃滤液，压紧并收集滤饼，即胰蛋白酶原粗品。,9,第九页，共十七页。,2、胰蛋白酶原的激活 将胰蛋白酶原粗品称重（湿重），分次加入10倍体积预冷的蒸馏水（
7、按滤饼重量计算），使滤饼完全溶解（一般情况滤饼中硫酸铵含量约占饼重1/4）。用5mol/L NaOH将溶液调至pH8.0，慢慢地搅拌下加入固体无水CaCl2使溶液的Ca2+终浓度达到0.1mol/L（要减去一部分氯化钙与硫酸铵结合(jih)生成硫酸钙的钙离子）。取出2mL溶液用于测定激活前的蛋白含量及酶活性。原溶液中加入5mg结晶胰蛋白酶，轻轻搅拌均匀，25放置24h，或4放置1216h，使胰蛋白酶原活化。每隔1h取样测定胰蛋白酶活性增长情况，直至酶激活速度变慢或停止增长。一般比活可达到3 5004 000 BAEE单位/mg。留取2mL溶液用于测定激活后的蛋白质含量和酶活性。激活酶溶液用2m
8、ol/L硫酸调pH至 2.53.0，滤纸过滤，滤去硫酸钙沉淀，收集滤液，4保存备用。,10,第十页，共十七页。,方法二 称取冷冻猪胰脏100g，在25下解冻，切成小块，用组织捣碎机中绞碎成胰浆，在510存放24h以上，使胰酶自身活化。胰浆中加入25%（质量分数）乙醇溶液250mL（25%乙醇溶液中加 0.015mol/L HCl、0.05mol/L CaCl2），捣碎机中捣碎1min。胰浆倒入500mL烧杯中，间隙搅拌，温度20左右，活化56h。每隔1.5h，吸取2mL活化液用于测定激活后的蛋白质含量和酶活性。活化反应结束后，胰浆 3 500 r/min离心20min，将离心后上清液用二层纱布
9、过滤。滤液置250mL烧杯中，以过滤清液的体积为准，加入粉末状硫酸铵，搅拌溶解，使溶液硫酸铵饱和度为20%。放置 6h后，3 500 r/min离心20min，保存上清液待用，取沉淀。沉淀分别用适量95%乙醇洗涤(xd)过滤，再用丙酮洗涤(xd)，过滤。最后将沉淀置于表面皿上自然干燥，即得胰蛋白酶粗品。,11,第十一页，共十七页。,在上述离心(lxn)上清液中，加入粉末状硫酸铵，搅拌溶解，使上清液溶液达到55%硫酸铵饱和度，放置 6h后，3 500 r/min离心(lxn)30min，取离心(lxn)沉淀，分别用适量95%乙醇、丙酮洗涤，过滤后将沉淀置于表面皿上自然干燥，即得胰蛋白酶粗品。,1
10、2,第十二页，共十七页。,三、脱盐精制离子交换(l z jio hun)层析法,原理：同类型的带电离子间可自由地相互交换和竞争结合。蛋白质在其等电点以下（pHpI），带正电荷，可被阳离子交换树脂所吸附；相反则带负电荷，可被阴离子交换树脂所吸附。上步实验中所得的猪胰蛋白酶等电点为pI=10.8，在pH=5.0的缓冲液中猪胰蛋白酶带正电，可被阳离子交换树脂吸附（本实验用CM-纤维素离子交换树脂）；则带负电的杂蛋白不被吸附而除去，带正电的杂蛋白也被吸附，但不同蛋白与树脂的吸附能力不同，通过增加缓冲液中的离子强度及提高pH，可将蛋白从树脂上洗脱下来。在不同的离子强度下，可将不同的蛋白分别洗脱（结合力弱
11、的蛋白最先洗脱，结合力强的蛋白最后洗脱）。通过以上离子交换层析法，即可将目的(md)蛋白和杂蛋白分开，从而得到纯化。,13,第十三页，共十七页。,14,第十四页，共十七页。,具体步骤,1、柱的平衡：用0.01mol/L，pH5.0柠檬酸钠缓冲液平衡CM-纤维素离子交换柱2、样品吸附：用恒流泵直接上样于CM-纤维素离子交换柱3、洗涤：以0.01mol/L，pH5.0柠檬酸钠缓冲液充分洗净未吸附蛋白质4、洗脱1：用0，,05mol/L，pH5.0柠檬酸钠缓冲液洗脱，并收集部分样品，测定每个样品的蛋白含量，做层析曲线，将出现一个层析峰，此峰值为猪胰凝乳蛋白酶5、洗脱2：待胰凝乳蛋白酶峰过后，改用0.
12、1mol/L，pH6.0柠檬酸钠缓冲液洗脱，并分部收集样品，重复(chngf)上步步骤，将出现一个蛋白峰，此峰值为猪胰蛋白酶6、柱的再生,15,第十五页，共十七页。,感谢(gnxi)观赏,6/27/2023,16,第十六页，共十七页。,内容(nirng)总结,胰蛋白酶的脱盐及精制方法。在动物胰脏中除了存在胰蛋白酶外，还有另外两种与胰蛋白酶性质相似的蛋白水解酶：胰凝乳蛋白酶和弹性(tnxng)蛋白酶。提取液用折叠滤纸于玻璃漏斗中自然过滤，收集滤液，量取体积（约200mL左右）。蛋白质在其等电点以下（pHpI），带正电荷，可被阳离子交换树脂所吸附。1、柱的平衡：用0.01mol/L，pH5.0柠檬酸钠缓冲液平衡CM-纤维素离子交换柱。3/1/2022。16,第十七页，共十七页。,
