1、研究报告 年第 卷第 期（总第 期）：引用格式：侯英婕，杨豪，黄文章，等 基于代谢途径改造谷氨酸棒杆菌生产 缬氨酸 食品与发酵工业，（）：，（）：基于代谢途径改造谷氨酸棒杆菌生产 缬氨酸侯英婕，杨豪，黄文章，徐建中，张伟国，（江南大学 生物工程学院，江苏 无锡，）（工业生物技术教育部重点实验室（江南大学），江苏 无锡，）摘 要 缬氨酸是一种重要的支链氨基酸，随着市场对其需求量的不断提升，进一步提高 缬氨酸的产量和糖酸转化率具有重要意义。在该研究中，使用实验室保藏的谷氨酸棒杆菌 作为出发菌株，通过对缬氨酸合成路径进行代谢改造显著提高了 缬氨酸的产量和丙酮酸前体物的供应。首先，通过敲除（编码乳酸脱
2、氢酶）、（编码丙酮酸氧化酶）、（编码丙酮酸羧化酶）基因以及弱化（编码丙氨酸转氨酶）基因表达来实现丙酮酸的富集。其次，通过强启动子 替换 操纵子原始启动子并增加（编码乙酰羟酸合酶）基因拷贝数来增强丙酮酸向 缬氨酸合成的碳代谢流。最后，通过过表达支链氨基酸转运蛋白编码基因 和调节蛋白编码基因 增强 缬氨酸胞外输出效率。最终构建的重组菌株 在 生物反应器中进行补料分批培养，缬氨酸产量可到达（），生产强度为 （），糖酸转化率为 葡萄糖。关键词 缬氨酸；谷氨酸棒杆菌；代谢工程；丙酮酸；发酵第一作者：硕士研究生（张伟国教授和徐建中副教授为共同通信作者，：；）基金项目：国家重点研发计划项目（）收稿日期：，改
3、回日期：缬氨酸是一种支链氨基酸（，），在哺乳动物生长和代谢中发挥着重要作用。在工业生产上，缬氨酸广泛应用于化妆品，制药，食品添加剂，动物饲料等领域。尤其在动物饲料行业，缬氨酸被证明可以显著改善母猪和母鸡的生产性能，同时作为一种必需氨基酸，缬氨酸也是低粗蛋白日粮中最具限制性的 种氨基酸之一。随着市场需求的不断扩增，进一步提高缬氨酸产量显得尤为重要。缬氨酸主要由微生物发酵生产，常用的生产菌株为谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等，其中谷氨酸棒杆菌具有氨基酸产率高、稳定性好、生物安全等特性，是 缬氨酸生产的主要菌株。在谷氨酸棒杆菌中 缬氨酸的合成路径较为明确，丙酮酸是 缬氨酸合成的重要前体，丙酮酸
4、 在 乙 酰 羟 酸 合 酶（，）、乙酰羟酸异构还原酶、二羟酸脱水酶和支链氨基酸转氨酶的催化下生成 缬氨酸，其中 催化的反应是 缬氨酸生物合成途径最具限制性的步骤之一。目前，诱变育种是工业 缬氨酸生产菌株的主要来源，但依靠传统诱变策略提高 缬氨酸产量显然已经不能满足生产需要。针对于 缬氨酸合成途径使用不同强度的启动子调节关键基因的表达，采用酶工程策略改造关键酶的催化结构域和调节结构域，增强 缬氨酸转运蛋白运输效率以及基于转录因子的生物传感器筛选高产菌株等多系统代谢工程策略已用于提高谷氨酸棒杆菌中 缬氨酸的生产。菌株谷氨酸棒杆菌 为实验室诱变选育的一株 缬氨酸生产菌株。在本研究中，使用菌株 作为
5、底盘菌株，为进一步提高 缬氨酸产量，对 缬氨酸合成路径进行代谢改造（图）。首先，为提高丙酮酸前体的利用率，敲除、以及 基因并通过插入 终止子下调 基因的表达水平。其次，通过 启动子替换 操纵子天然启动子以及增加 基因拷贝数强化 缬氨酸的合成路径。最后，通过过表达支链氨基酸转运蛋白编码基因 和调控蛋白编码基因 增强 缬氨酸胞外输出效率得到一株最佳 缬氨酸生产菌株。材料与方法 菌株、质粒和引物本研究使用的所有菌株、质粒及其相关特性见表，引物信息见附表（：）。食品与发酵工业 （）表 本研究所用质粒和菌株 菌株和质粒相关特征来源菌株大肠杆菌 （）（）实验室保藏谷氨酸棒杆菌野生型 实验室保藏 实验室保藏
6、本研究 本研究 本研究 本研究 本研究本研究 本研究质粒，实验室保藏，实验室保藏，本研究 ，本研究，本研究 ，本研究 ，本研究，本研究，本研究 乳酸脱氢酶；丙酮酸羧化酶；丙酮酸氧化酶；乙酰羟酸合酶；乙酰羟酸还原异构酶；二羟酸脱水酶；支链氨基酸转运蛋白；丙氨酸氨基转移酶图 缬氨酸在谷氨酸棒杆菌中的生物合成途径 培养基、试剂和仪器 培养基（）：胰蛋白胨，酵母提取物，；培养基（）：胰蛋白胨，酵母提取物，葡萄糖，；和 （）培养基按照参考文献的方法制备；培养基（）：胰蛋白胨，酵母提取物，甘油，；种子培养基（）：葡萄糖，（），维生素 ，玉米浆，；发酵培养基（）：葡萄糖，（），玉米浆，。基因组提取试剂盒、质
7、粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、连接酶、高保真 酶、限制性核酸内切酶，诺唯赞生物科技（南京）股份公司；引物，亦欣生物科技（上海）有限公司；其他试剂均为国产或进口试剂。高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公司；固定化酶生物传感器，山东省科学院生物研究所；分光光度计，日本岛津公司。质粒的构建 敲除质粒的构建 通过两步同源重组用于所有基因序列的敲除和整合。以谷氨酸棒杆菌 的基因组作为模板以相应的引物对扩增出 基因上下游研究报告 年第 卷第 期（总第 期）左右片段。通过重叠延伸 将 基因的上游同源部分和下游同源部分连接起来。使用和 双酶切 质粒和目的片段，胶回收目的片段和质粒片段，使用 接酶将经过相同酶切处理的
8、质粒片段与目的片段连接起来，构建出 质 粒。以 野 生 型 谷 氨 酸 棒 杆 菌 基因组为模板以 和 引物对 得到 启动子。将 启动子与 基因启动子上下游 左右同源序列通过重叠延伸 连接起来，使用 和 酶切 质粒和片段。然后通过 连接酶进行连接构建 质粒。、质粒的构建同上，所有质粒构建好后均通过酶切验证构建成功。过表达质粒的构建以谷氨酸棒杆菌 的基因组作为模板，以 和 引物对扩增得到 基因片段，使用 和 酶切 片段和 质粒。随后用 连接酶将经过相同酶切处理的 质粒与目的片段连接起来构建 过表达质粒。质粒的构建过程同上。发酵方法 摇瓶发酵使用接种环将保藏在甘油管中的菌株接种至固体培养基平面上进
9、行活化，将活化好的菌种接种到 液体培养基 ，培养 ，取 活化好的菌液加入装有 种子培养基的 三角瓶中 ，培养 扩大培养至 值为 ，左右。以 接种量将扩培好的种子液接种至 发酵培养基中，培养 。当菌株含有过表达质粒时，向培养基中加入 卡那霉素，并在检测发酵培养基 值到达 时添加 诱导质粒表达。发酵罐发酵发酵罐的装液量为 ，将活化好的种子液以的接种量接种至发酵罐中，通过流加氨水维持 保持在 左右，通过控制转速和通风量使发酵罐中的溶氧保持在 以上，通过流加 葡萄糖溶液使残糖质量浓度保持在 左右。每隔 取 次样，发酵时间为 。检测方法在发酵过程中，发酵液中的残糖浓度通过 固定化酶生物传感器进行测定；取
10、 菌液用 稀盐酸稀释 倍后使用分光光度计测量菌液 值。缬氨酸的含量通过 进行分析，具体检测方法参考文献。结果与分析 提高丙酮酸前体物利用率前体物质的补充是提高目标产物强有力的策略之一。丙酮酸是 缬氨酸合成的重要前体，同时也是菌体碳代谢的关键节点，对丙酮酸碳通量进行再分配有利于 缬氨酸的合成。丙酮酸节点包括一系列代谢途径，其中乳酸合成途径、醋酸合成途径以及丙氨酸合成途径是谷氨酸棒杆菌有氧发酵的冗余途径，对上述代谢途径中的基因进行修饰不仅有利于丙酮酸的富集也可以减少 缬氨酸合成过程中副产物的生成，。在菌株 中依次敲除编码丙酮酸氧化酶编码基因、乳酸脱氢酶编码基因 并使用 终止子弱化丙氨酸转氨酶编码基
11、因 构建重组菌株 来研究上述基因缺失和修饰对于 缬氨酸合成以及副产物生成的影响。如图 和图 所示，重组菌株 产生（）的 缬氨酸，比原始菌株 缬氨酸产量高 ，而在耗糖速率和菌体生长并没有明显变化。如图 所示，菌株 有氧发酵过程中最主要的副产物为 丙氨酸（），其次为 异亮氨酸（）和乳酸（），上述基因的敲除使 丙氨酸（）和乳酸（）生成量有所下降，但造成了 异亮氨酸生成量（）的增多。这说明丙酮酸节点处副产物合成路径相关基因的敲除使得更多丙酮酸前体流向了支链氨基酸的合成。有研究对 缬氨酸高产菌株进行转录组学分析表明 基因和 基因以及 基因表达水平的下调可能对于 缬氨酸合成具有正效作用，我们的研究结果与其
12、一致。随后我们又测试了敲除 基因以及过表达 基因对于 缬氨酸合成的影响。在谷氨酸棒杆菌中，基因编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶催化丙酮酸生成草酰乙酸，基因编码苹果酸酶催化苹果酸生成丙酮酸并产生。在重组菌株 中敲除 基因构建重组菌株，缬氨酸产量为（），相较于重组菌株 缬氨酸产量提高了 ，同时生食品与发酵工业 （）长有所下调。基因的缺失似乎对于丙酮酸的富集做出了较大的贡献，重组菌株 缬氨酸产量的显著提升说明阻断草酰乙酸回补路径使更多的丙酮酸流向了缬氨酸的合成路径。而在重组菌株 中进一步过表达 基因构建的重组菌株 并没有显示出 缬氨酸产量的进一步提高。这可能是因为 基因编码的苹果酸酶是可逆催化酶，在富集丙
13、酮酸过程中并不发挥作用。菌株、和 生长情况和葡萄糖消耗比对；菌株、和 缬氨酸产量对比；菌株、副产物生成量比对图 菌株、和 摇瓶发酵结果 ，强化 缬氨酸合成路径 基因编码的 是 缬氨酸合成过程中的关键酶，操纵子在 缬氨酸合成过程中具有重要作用。据文献报道 操纵子的过度表达可以显著提高 缬氨酸的产量。因此我们使用强启动子 替换重组菌株 原始启动子构建重组菌株，并在重组菌株 中增加 基因的拷贝数进一步增加 基因的表达。强启动子 和 基因以及终止子构建成一个表达框插入重组菌株 基因缺失处构建重组菌株。将构建好的重组菌株进行摇瓶发酵实验，如图 所示，重组菌株 缬氨酸产量为（），相较于重组菌株 缬氨酸产量
14、提高了 ，耗糖速率有所提高。进一步增加 基因拷贝数构建的重组菌株 缬氨酸产量为（）相较于重组菌株 也略有提升。这说明 基因的增强表达提高了糖摄取效率以及胞内 和乙酰羟酸异构还原酶的浓度，促进更多的丙酮酸流向 缬氨酸的合成。增强 缬氨酸胞外运输效率缬氨酸过度的胞内积累不利于 缬氨酸生产，缬氨酸的外排已被证明是降低细胞内 缬氨酸水平和缓解由 缬氨酸累积引起的反馈抑制的有效方法。基因编码转运蛋白（）可以运输胞外的支链氨基酸进入胞内，为了减少 缬氨酸向胞内的运输，在重组菌株 中敲除 基因构建重组菌株。对重组菌株 进行摇瓶发酵培养，缬氨酸产量为（），菌体生长有所下调。有文献报道，蛋白主要负责异亮氨酸的胞
15、内输送，这可能是 基因敲除对 缬氨酸合成几乎无影响的原因。基因编码支链氨基酸胞外转运蛋白，同时也负责 甲硫氨酸的胞外转运。有研究表明，基因编码的 因子可以调控 基因的表达。同时过表达 基因和 基因有利于 缬氨酸生产。因此我们在重组菌株 中电转入 、构建重组菌株、。对重组菌株进行摇瓶发酵如图 所示，缬氨酸产量分别为（）、（）。结果表明，共表达 基因和 基因可以提高 缬氨酸胞外运输效率，减少 缬氨酸胞内累积从而促进 缬氨酸生产，但值得注意的是，的 值（）相较于（）下降了 ，共表达 和 基因在提高 缬氨酸合成的同时似乎也给菌体生长带来了一定的负担。发酵罐补料分批发酵根据上述研究结果，重组菌株 和 均
16、具有较好的 缬氨酸生产性能。在摇瓶发酵过程中，重组菌株 具有最佳的 缬氨酸生产能力，但相较于 的 值有所降低。菌体生物量的降低可能会影响发酵过程中产物的生产稳定性，因此选取菌株 和 进行 发酵罐放大发酵实验进行生产性能的进一步验证。对重组菌株 和 进行 发酵罐补料分批发酵实验，研究报告 年第 卷第 期（总第 期）并以出发菌株 作为对照，发酵结果如图 所示。在补料分批发酵过程中，菌株 缬氨酸产量为（），相较于原始菌株（）提高了，重组菌株 缬氨酸产量为（），相较于原始菌株（）提高了 。从实验结果来看，菌株 在摇瓶发酵和 发酵罐放大发酵中均表现出最佳的 缬氨酸生产能力且生产性能 菌株、和 生长情况和葡萄糖消耗比对；菌株、和 缬氨酸产量对比图 菌株、和 摇瓶发酵结果 ，较为稳定，除此以外，重组菌株 糖酸转化率为 葡萄糖，相较于出发菌株（葡萄糖）提高了 。虽然重组菌株（）相较于出发菌株（）具有一定程度的下降，但是在糖酸转化率和缬氨酸产量上均有提升，因此推测用于菌体生长的部分碳通量可能用于 缬氨酸合成。菌株、和 生长情况和葡萄糖消耗比对；菌株、和 缬氨酸产量对比图 菌株、和 摇瓶发酵结果 ，菌株
