1、基金项目：国家重点研发计划项目（）作者简介：刘金莲（.），女，博士研究生在读，研究方向：中药药性与药效作用机制及物质基础研究，：.通信作者：张建军（.），女，博士，教授，博士研究生导师，研究方向：基于中药药性与临床应用的药效机制及物质基础研究，：.；胡培丽（.），女，硕士，副研究员，研究方向：食品化妆品安全性评价及功效研究，：.基于超高效液相色谱四级杆飞行时间质谱技术的清利湿热颗粒入血成分分析刘金莲 南海鹏 陶 然 陈亚文 邸松蕊 王林元 王 淳 潘平平 胡培丽 张建军（北京中医药大学中医学院，北京，；北京中医药大学中药学院，北京，；无限极（中国）有限公司，广州，；中国食品药品检定研究院，北京
2、，）摘要 目的：阐明灌胃给予清利湿热颗粒后大鼠体内吸收入血的化学成分。方法：借助超高效液相色谱四级杆飞行时间质谱（）技术，采用 色谱柱（.，.），以.甲酸水溶液乙腈为流动相体系，梯度洗脱，进样量为 ，在正、负离子模式下对处理后的空白血清和给药后.、不同时间点的血清进行质谱检测。结果：通过与 .数据库对比、文献分析以及质谱裂解规律从血清样品中鉴定出 个原型成分。结论：本研究为清利湿热颗粒标志性成分的选择提供了依据，初步确定了该产品发挥药效的物质基础，也为进一步揭示清利湿热颗粒的作用机制奠定基础。关键词 清利湿热颗粒；入血成分；超高效液相色谱四级杆飞行时间质谱；灌胃给药；落新妇苷；京尼平苷酸；葛根
3、素 ，（，；，；（），；，）：（），（.，.），.（.，）：.，：，；中图分类号：.文献标识码：近年来，随着社会的进步，人们的饮食习惯发生了变化，高尿酸血症的发病率也越来越高。清利湿热颗粒由土茯苓、车前子、茯苓、菊苣、葛根、川牛膝经水煎煮提取、浓缩、干燥、制粒而成，研究表明该中药配方可以降低血尿酸水平。中药复方在中医药理论指导下，运用“君、臣、佐、使”理论将上述 味中药进行配伍，土茯苓甘淡渗利，长于解毒除湿；车前子甘寒性降，善通利水道，二者相合，清热利湿泄浊，共为君药。茯苓渗湿利水以祛邪，健运脾胃以扶正；菊苣性凉，健胃消食，利尿消肿，二者配伍，助君健运脾胃，利湿除痹，共为臣药。佐药葛根既能升发
4、清阳，以助茯苓运化，又能生津止渴，可防利水太过耗伤津液。川牛膝性善下行，可利尿通淋，补益肝肾，既可助君祛湿除痹又可助臣补肾健脾，是为使药。其中茯苓、菊苣、葛根为药食两用中药，可针对湿热内蕴证型，特别是亚健康人群，达到清热利湿泄 ，浊、固护脾肾的效果。超高效液相色谱四级杆飞行时间质谱（，）技术具有灵敏、快速的特点，将传统中药与 现代科学技术结合可以为产品质量控制、明确药效物质奠定基础。清利湿热颗粒是经检测合格的产品，我们已进行了相关的药效学研究，证明该产品可以降低血尿酸水平，但其发挥作用的药效物质基础还需要进一步明确。本研究借助 技术，通过和 .数据库比对并参考相关文献以及化合物的裂解规律，分析
5、得到大鼠灌胃清利湿热颗粒后的入血成分，可以初步确定清利湿热颗粒发挥药效的物质基础，并在此实验基础上，为进一步揭示其作用机制提供依据。材料与方法.材料.动物 无特定病原体（，）级健康雄性斯泼累格多雷（，）大鼠，体质量（），购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，许可证号：（京）。饲养于北京中医药大学 级实验动物中心。动物房室温为 ，相对湿度 ，光照周期 ，实验符合相关伦理要求（伦理审批号：）。.药物清利湿热颗粒无限极（中国）有限公司，批号：，其中土茯苓（广东慧达康制药有限公司，批号：）、车前子（江山市万里中药材有限公司，批号：）、茯苓（安国市一方药业有限公司，批号：）、菊苣（江山市万里中药材有限公司
6、，批号：）、葛根（安国市一方药业有限公司，批号：）、川牛膝（四川新荷花中药饮片股份有限公司，批号：）。.试剂与仪器乙腈（公司，德国，批号：）；甲醇（公司，德国，批号：）；水（广州屈臣氏食品饮料有限公司，批号：）；甲酸（公司，上海安普，批号：）。超高效液相色谱仪（沃特世科技有限公司，型号：）；高分辨质谱（公司，美国，型号：）；电子天平梅特勒托利多国际贸易（上海）有限公司，型号：；超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司，型号：）；高速离心机（，德国，型号：）；冷冻离心机（，型号：）。.方法.分析条件.色 谱 条 件 色 谱 柱：（.，.）。柱温：。检测波长：。流速：.。进样量：。流动相比例：相乙腈，
7、相.甲酸水溶液，梯度见表。表 流动相梯度时间（）相（）相（）.质谱条件质谱检测模式：。质谱参数见表。.溶液的制备 只 大鼠适应性喂养 周后，实验前禁食不禁水 以上，按照.灌胃给药，分别于给药前 和给药后.、眼眶采血，每只约 。采血后静置 ，分离血清（，），总共 个时间点，每个时间点的 只动物样本合并，最后一共 个血清样本，各 。表 质谱参数质谱参数参数值串联质谱参数参数值 （）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）世界中医药 年 月第 卷第 期 分别吸取各时间点血清 ，加入 倍量甲醇（质谱级）沉淀蛋白，涡旋混匀 ，离心 （，），取上清液，离心浓缩干燥，保存放置。分析前残渣加 甲醇复溶，涡
8、旋混匀 ，离心 （，），取上清液，即得。结果采用 对灌胃清利湿热颗粒后的大鼠血清样品进行分析，根据样品多级质谱信息，结合天然产物高分辨质谱数据库及相关文献，从血清样品中鉴定出 个原型成分。见表，图 。图 血清样品 基峰离子流图（）负离子模式 数据采集软件为 .，数据处理软件为 .。鉴定时将质谱数据与 .数据库进行匹配，根据各色谱峰得分信息对化合物进行初步筛选，进一步根据各色谱峰一级、二级信息等对化合物进行确认。数据库中未收载的化合物则根据文献报道、质谱裂解规律等进行鉴定，各成分确定后对其进行药味归属，个原型成分中有 个成分来自土茯苓，个成分来自车前子，个成分来自葛根。.土茯苓中化学成分鉴定原型
9、成分、和 .数据库进行对比分析推测上述成分分别为新落新妇图 血清样品 基峰离子流图（）正离子模式图 给药血清 提取离子流图（）负离子模式 ，表 清利湿热颗粒给药血清样品原型成分鉴定结果序号时间（）加合离子 实际值 理论值分子式分子量中文名英文名 数据来源参考来源.京尼平苷酸车前子数据库 .葛根素葡萄糖 葛根 .葛根素.；.；.；.葛根数据库 .葛根素芹菜糖苷或异构体 .；.；.；.葛根 .甲氧基葛根素.；.；.葛根数据库 .葛根素芹菜糖苷或异构体 .；.；.；.；.；.葛根 .大豆苷葛根数据库 .车前素.；.车前子数据库 .新落新妇苷.；.土茯苓数据库 .落新妇苷.；.土茯苓数据库 .新异落新
10、妇苷.；.土茯苓数据库 .异落新妇苷土茯苓 .芒柄花苷.；.葛根数据库 .大豆苷元.；.；.葛根数据库 .毛蕊异黄酮葛根数据库 图 给药血清 正离子模式提取离子流图（）正离子模式苷（）、落新妇苷（）、新异落新妇苷（），原型成分 负离子模式下分子离子峰为 .，推断化学式为，原型成分、为同分异构体，和文献中的化合物质谱信息对比后推测原型成分 为异落新妇苷（）。.车前子中化学成分鉴定原型成分、和 .数据库进行对比分析推测上述成分分别为京尼平苷酸（）和 车 前 素（）。.葛根中化学成分鉴定原型成分、和 .数据库进行对比分析推测上述成分分别为葛根素（）、甲氧基葛根素（）、大豆苷（）、芒柄花苷（）、大豆苷
11、元（）、毛蕊异黄酮（）；原型成分 正离子模式下分子离子峰为 .，推断化学式为，和文献中的化合物质谱信息对比后推测原型成分 为葛根素葡萄糖（），原型成分 正离子模式下分子离子峰为 .，推断化学式为，原型成分 正离子模式下分子离子峰为 .，推断化学式为，和 为一对同分异构体，和文献中的化合物质谱信息对比后推测原型成分 和 为葛根素芹 菜 糖 苷 或 异 构 体（）。讨论本研究基于 技术，定性分析了清利湿热颗粒给药后的入血原型成分，可在此基础世界中医药 年 月第 卷第 期上为本产品的体内代谢研究提供依据。入血成分分析结果表明口服清利湿热颗粒后，个原型成分在.、不同时间点均存在，表明以上成分相对稳定，
12、初步揭示了这些成分可能是发挥药效的物质基础。个原型成分分别来自土茯苓、车前子、葛根，但是菊苣、茯苓、川牛膝中暂未检出相关成分，可能因茯苓、菊苣主要成分为多糖等大分子不容易检测出；川牛膝主要成分包括甾酮类成分，极性相对较小，不易水提取出，也有可能因部分成分在体内已不再以原型成分存在而成为代谢物以及经过一系列工艺后部分成分含量降低不易检出等。土茯苓中落新妇苷、车前子中京尼平苷酸、葛根中葛根素均为药典中相应药材规定的标志性成分，清利湿热颗粒是由水煎煮提取得到，不同溶剂提取出的成分种类和数量不同，已有文献报道车前子中的京尼平苷酸在水中的溶解度相对较小，并且京尼平苷酸这一成分在谱图中的峰较小，含量较低，
13、故不考虑作为标志性成分。土茯苓的成分主要为黄酮类，其中已有研究表明落新妇苷可以缓解高尿酸血症及由其引发的肾损伤，葛根中的葛根素可以通过抑制黄嘌呤氧化酶活性抑制尿酸生成，故本研究再次验证落新妇苷、葛根素作为清利湿热颗粒标志性成分的合理性。中药复方具有多成分、多靶点的特点，通过对中药复方功效成分（功能因子）开展研究，可以初步反映其内涵机制。个入血原型成分为本产品初步确定的药效物质基础，同时，在现有研究基础上可深入研究多个单体成分的作用，进一步构建药物成分靶点网络，进而为揭示产品作用机制提供依据。同时，也为中药复方的机制研究提供了方法学参考。利益冲突声明：无。参考文献，：，：，：，（）：邸松蕊，刘金
14、莲，余淑惠，等 利清通方对高尿酸血症大鼠的降血尿酸作用及对尿酸生成限速酶与尿酸转运体的影响 环球中医药，（）：王林元，王淳，张建军，等 辨证保健理论体系的构建 中华中医药杂志，（）：车爽 联合 技术在中药分析领域的应用进展 天津药学，（）：蒋宁，杜保民，杜冠华，等 新思路新技术 中药复方新药研发相关重大科学和技术问题 中国药理学与毒理学杂志，（）：，（）：王敏，陈文龙，王志仁，等 型大孔吸附树脂对土茯苓总黄酮的富集纯化作用 中成药，（）：洪方，闫艳，赵雷，等 基于 鉴定葛根汤的入血成分及其代谢产物 中国中药杂志，（）：李彤，李宇，张彩娟，等 基于 的葛根芩连汤治疗溃疡性结肠炎血清药效物质基础研究 中国中药杂志，（）：王昱涵，王志萍，谢谭芳，等 技术在中药及中药复方制剂研究中的应用 中国药师，（）：王奥奥，李磊，李瑛，等 中药来源多肽类活性成分治疗缺血性心脑血管疾病的研究进展 中国中药杂志，（）：王莉婷，李颜伶，徐广，等 基于 技术的车前子不同溶剂提取物成分分析 中国药师，（）：，：曾慧玲，蒋且英，赵国巍，等 基于共无定形技术葛根素改善黄芩苷物理稳定性和溶出度及其机制研究 中草药，（）：庄朋伟，韩旭，陈远兴，等 中药复方保健产品核心功效的现代科学内涵研究策略与方法 中华中医药杂志，（）：（收稿 本文编辑：张晓辉），
