1、实用医学杂志2023年第39卷第9期The Journal of Practical Medicine2023 Vol.39 No.9不同分期矽肺患者气道细菌群落微生态研究荆茹1孟凡利2李旭东1，21广州医科大学公共卫生学院（广州 511436）；2广东省职业病防治院，广东省职业健康工程技术研究中心，广东省职业病防治重点实验室（广州 510300）【摘要】目的探讨不同分期矽肺患者气道细菌微生物构成的差异。方法采用立意抽样方法，选择29例职业性矽肺病患者，13例健康受试者为研究对象，其中矽肺壹期患者6例（矽肺壹期组），矽肺贰期患者15例（矽肺贰期组），矽肺叁期患者8例（矽肺叁期组）。采集42例受
2、试者痰液样本，采用16S rDNA测序技术检测痰液样品中细菌微生物，分析4组受试者细菌微生物的相对丰度差异，对健康受试者与矽肺患者组间存在差异的细菌微生物进行物种多样性指数（alpha多样性指数、beta多样性指数）差异分析；绘制受试者工作特征曲线（ROC）评估细菌微生物作为生物标记物的可行性。结果健康受试者与矽肺患者痰液样品中奈瑟菌属（Neisseria）、莫拉氏菌属（Moraxella）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、棒状杆菌属（Corynebacterium）、狡诈球菌属（Dolosigranulum）、密螺旋体菌属（Treponema）相对丰度分别比较，差异均有统计学意义
3、（P 0.05）。LEfSe分析结果显示，矽肺壹期组增加的物种包括Neisseria、奈瑟氏菌科（Neisseriaceae）、假单胞菌目（Pseudomonadales）和莫拉菌科（Moraxellaceae）；矽肺贰期组增加的物种有芽孢杆菌科（Bacillacea）、芽孢杆菌属（Bacillus）、Staphylococcus、葡萄球菌科（Staphyloccaceae）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus_aureus）。ROC曲线分析结果显示，采用Neisseria相对丰度对矽肺壹期与矽肺贰期患者进行分期诊断的ROC曲线下面积为0.87（95%置信区间0.710.99），灵敏
4、度100.0%，特异度73.3%，约登指数0.73，P=0.01。结论Neisseria可能与矽肺患者的疾病进程有关，并可能具备对矽肺分期进行区别的生物标记物的潜力。【关键词】矽肺；细菌；微生物；高通量测序【中图分类号】R135Microecological study of airway bacterial community in patients with silicosis in different disease stagesJING Ru*，MENG Fanli，LI Xudong.School of Public Health，Guangzhou Medical Universi
5、ty，Guangzhou 511436，ChinaCorresponding author：LI XudongEmail：【Abstract】ObjectiveTo investigate the composition in bacterial microbial composition in silicosis patients with different stages.Methods13 healthy subjects，29 patients with occupational silicosis，including 6 patients with silicosis I，15 pa
6、tients with silicosis and 8 patients with silicosis.The sputum of four groups ofsubjects was collected，16S rDNA sequencing technology was used to detect bacterial microorganisms in the sputum samples，and the relative abundance of bacterial microorganisms and the difference of microbial diversity ind
7、ex（alpha diversity index，beta diversity index）were analyzed；the subject working characteristic curve（ROC）was drawn to assess whether bacterial microorganisms have the potential of biomarkers.ResultsThe relative abundance of Neisseria，Moraxella，Staphylococcus，Corynebacterium，Dolosigranulum and Trepon
8、ema in sputum samples of subjects（P values 18岁。排除标准：罹患其他肺部疾病（如肺部肿瘤、肺结节、囊性纤维化等）或既往进行过肺部手术者；罹患其他炎性疾病者；近 4 周内因其他疾病使用了抗生素或接受过输血治疗者；正在接受全身激素治疗者；正在参加双盲药物临床试验者；长期食用益生菌类食品者。本研究通过广东省职业病防治院医学伦理委员会审核批准；研究对象均签署知情同意书。1.2痰液样品采集采集研究对象入院24 h内的自主咳痰的痰液样品2 mL/人。样本采集时，嘱患者咳深部痰于无菌痰杯中，于1 h内送至-20 的冰箱内保存，1 周内转运至-80 的冰箱内保存待检
9、。1.316S rDNA 测序技术检测痰液中细菌微生物采用十六烷基三甲基溴化铵法（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）从 痰 液 样 品 中 提 取DNA，取2 mL样品DNA用无菌水稀释至质量浓度为1 g/L，以此为模板，采用带有barcode序列的特异性引物（美国Bioo Scientific公司）进行目标区域的聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）（中国诺禾致源公司，Novo G100）扩增。扩增区域为V4区；扩增引物名称：515F，806R；引物序列（方向 5端-3端）为：GTGCCAGCMGCCGCGGTAA，
10、GGACTACHVGGGTWTCTAAT。采用 TruSeqDNA PCRFree 试剂盒（美国Illumina公司）按照说明书步骤生成测序文库22。扩增产物由北京诺禾致源科技股份有限公司基于Illumina NovaSeq6000PE250平台（美国Illumina公司）进行文库测序。1.4生物信息学分析（1）采用 R 语言软件 R.V2.5.3对物种丰度矩阵文本库绘制物种累积箱型图，以衡量测序深度和样品数量是否能有效反映样品中的群落结构情况23。（2）采用 Qiime 软件（V1.9.1）计算 3 组矽肺患者痰液样品中细菌微生物群落Alpha多样性的相关指数，并进行Beta多样性 的 主
11、坐 标 分 析（principal coordinate analysis，PCoA）。PCoA图展示样品间细菌微生物的总体相似性，为细菌微生物的可视化聚类情况，由第一主坐标和第二主坐标分别解释总变异的程度24-25。Alpha 多样性表示在生物样品中微生物物种在空间和时间上的相对丰度，其描述指标主要包括Shannon指数、Simpon指数、Chao1指数和ACE指数等，可用来描述生态失调26；其中，Simpson指数与1106实用医学杂志2023年第39卷第9期The Journal of Practical Medicine2023 Vol.39 No.9Shannon 指数可衡量微生物群
12、落的多样性；Chao1指数与ACE指数用于衡量微生物群落丰度，指数越大说明群落丰富度越高2729。Beta多样性分析用以衡量细菌群落组成如何随时间或空间而变化，可分析不同群落之间物种多样性的变化趋势30。（3）采用非参数检验的分子方差分析（analysis of molecular variance，AMOVA）进行基于非加权Unifrac距离时3组组间差异检验31。（4）采用线性判别分析（linear discriminant analysis，LDA）效应大小（LDA effect size，LEfSe）方法分析 3 组患者痰液样品中细菌菌属的相对丰度，筛选关键菌属，默认的LDA分数的筛选
13、值为432。1.5统计学分析采用 SPSS 25.0 软件进行统计分析。计量资料经正态性检验不符合正态分布者，采用中位数（M）描述。两组组间 M 比较采用MannWhitney U 检验，多组组间 M 比较采用 KruskalWalis H 检验。采用受试者工作特征（receiveroperator characteristic curve，ROC）曲线评估关键菌属作为生物标记物对矽肺分期进行区别的可行性；当 ROC 曲线下面积（the area under the ROCcurve，AUC）0.50 时，证明该诊断试验具有一定的诊断价值；AUC 值越接近 1.000，证明诊断试验的真实性越好
14、3335。检验水准=0.05（双侧）。2结果2.1各组细菌菌群相对丰度比较健康受试者与3组矽肺患者痰液样品中奈瑟菌属（Neisseria）、莫拉菌属（Moraxella）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、棒状杆菌属（Corynebacterium）、狡诈球菌属（Dolosigranulum）、密螺旋体菌属（Treponema）相对丰度分别比较，差异均有统计学意义（P 0.05）。见表1。表14组受试者痰液样品中细菌微生物相对丰度比较结果Tab.1Comparative results of relative abundance of bacterial microorganisms
15、 in sputum samples%组别健康对照组矽肺壹期组矽肺贰期组矽肺叁期组H值P值患者数（例）136158Neisseria3.40（0.74，11.69）abc1.66（0.92，1.20）0.41（0.024，0.78）a0.39（0.22，2.62）10.88 0.01Moraxella0.00（0.00，0.01）bc0.79（0.00，6.59）0.47（0.02，0.87）0.01（0.00，0.02）b19.52 0.01Staphylococcus0.22（0.20，3.93）0.68（0.46，2.10）0.94（0.62，1.88）0.21（0.14，0.56）b9
16、.65 0.01Corynebacterium0.15（0.09，0.33）b0.23（0.19，0.34）0.73（0.34，1.64）a0.25（0.16，0.46）15.81 0.01Dolosigranulum0.04（0.02，0.13）b1.04（0.41，2.33）0.42（0.30，0.45）0.29（0.01，0.30）a18.28 0.01Treponema0.59（0.36，1.52）bc0.51（0.13，2.08）0.21（0.11，0.31）0.03（0.01，0.10）ab15.59 0.01注：与矽肺壹期组比较，AP 0.05；与矽肺贰期组比较，BP 0.05；与矽肺叁期组比较，CP 矽肺叁期 矽肺贰期。见表2。2.4Beta 多样性分析基于非加权 Unifrac 距离进行 PCoA，结果显示，第一主坐标差异贡献率为30.27%，第二主坐标差异贡献率为10.81%，该两个主坐标共解释了 41.08%的差异，即 3 组矽肺患者组间群落多样性有差异。见图2。AMOVA分析结1375913111715211923272529样本编号5001 000 1 500
