1、一、免疫细胞(xbo)的特征,1、免疫细胞的形态学特征 理化性状 生物学特性(txng)2、免疫细胞的膜分子特征 CD分子,第一页，共七十五页。,第二页，共七十五页。,NK cells,吞噬(tnsh)溶酶体,第三页，共七十五页。,第四页，共七十五页。,二、免疫细胞(xbo)的分离技术,1、密度梯度离心法2、黏附分离法3、荧光(ynggung)激活分离法4、磁性分离法5、其他分离法,第五页，共七十五页。,1、密度梯度离心法,聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)(F/H)分层液Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，亲水性高，平均分子量为400,000，当密度为1.2g/ml仍未超
2、出正常生理性渗透压，也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重(bzhng)大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重(bzhng)小于或等于分层液比重(bzhng)，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。,第六页，共七十五页。,离心(lxn)前,离心(lxn)后,稀释(xsh)抗凝血,淋巴细胞分离液,血浆,单个核细胞,粒细胞,红细胞,第七页，共七十五页。,2、黏附(ninf)分离法-纯淋巴细胞群的分离,贴壁法：将已制备的单个核细胞悬液倾于玻璃或塑料平皿或扁平小瓶中，移至37温箱静置1h左右(zuyu)，单核细胞和粒细胞均贴
3、于平皿壁上，而未贴壁的非粘附细胞几乎为纯淋巴细胞，继用橡皮刮下贴壁的细胞即为纯单核细胞群。因B细胞也有贴壁现象，用本法分离的淋巴细胞群中B细胞有所损失。,第八页，共七十五页。,2、黏附(ninf)分离法：淋巴细胞亚群的分离,尼龙毛法：混合(hnh)单个核细胞悬液在通过尼龙毛柱时，B细胞、浆细胞、单核细胞和一些辅助细胞被选择性粘附于尼龙毛上，而多数T细胞则通过尼龙毛柱，这是获得富含T细胞群的有效方法。T细胞得率为20-30%左右。亲和板法：利用亲和层析法分离淋巴细胞亚群，其原理是各种淋巴细胞亚群具有不同的抗原性，将相应抗体结合于塑料平板上，继加细胞悬液，凡抗原阳性的细胞则与相应抗体结合，抗原阴性
4、的细胞可从未吸附的细胞悬液中获取。吸附柱法：将单个核细胞悬液注入装有玻璃纤维或葡聚糖凝胶SephadexG10的柱层中，凡有粘附能力的细胞绝大部分被吸附而粘滞在柱层中，从柱上洗脱下来的细胞主要是淋巴细胞。此法简单易行，对细胞极少损害。,第九页，共七十五页。,3、荧光(ynggung)激活分离法（FACS）,第十页，共七十五页。,流式细胞仪,第十一页，共七十五页。,4、磁性(cxng)分离法,（1）磁铁吸引法：利用单核细胞具有吞噬的特性，在单个核细胞悬液中加直径为3m的羰基铁颗粒，置37温箱内短时旋转摇动，待单核细胞充分吞噬羰基铁颗粒后，用磁铁将细胞吸至管底，上层液中含较纯的淋巴细胞。（2）磁激
5、活细胞分离术MACs：是一种特异性细胞分选技术，其高度特异性来自抗体对抗原的特异性识别。主要组成成分为MACS微珠、MACS分选柱和MACS分选器。MACS微珠是与高度特异性单克隆抗体相偶联的超顺磁化微粒。MACS分选柱置于一个永久性磁场MACS分选器中，可以将磁力增强1000倍，足以滞留(zhli)仅标记极少量微珠的目的细胞。用缓冲液冲洗分选柱，所有未标记的细胞被冲洗掉。分选柱离开磁场，即可获得被标记的细胞组分。,第十二页，共七十五页。,MACS(阳性(yngxng)选择法）,N,S,第十三页，共七十五页。,MACS(阴性(ynxng)选择法）,N,S,第十四页，共七十五页。,第十五页，共七
6、十五页。,第十六页，共七十五页。,5、其他(qt)分离法,花环沉降法：本法是将淋巴细胞与一定比例的绵羊红细胞混合，待淋巴细胞形成E花环后，继用淋巴细胞(xbo)分层液分离细胞(xbo)。浮悬在分层界面而不形成E花环的群则富含B细胞，而沉降在管底的形成E花环的细胞用低渗法处理，使围绕细胞周围的绵羊红细胞快速裂解，则获得纯的T细胞。可溶性MHC-肽四聚体法：mhc-肽四聚体复合物的原理是通过增强t细胞受体与mhc-肽复合物亲和力，达到可直接特异性检测t细胞的目的。作为临床诊断工具，定量检测外周血及组织中抗原特异性CTLs的比率，并进行表型及功能分析。用于过继性肿瘤免疫治疗用于疫苗疗效的监测,第十七
7、页，共七十五页。,抗原(kngyun)肽-MHC分子四聚体技术,第十八页，共七十五页。,MHC I类(左)和类(右)分子(fnz)四聚体结构示意图,第十九页，共七十五页。,三、细胞(xbo)的冻存与复苏,1、细胞冻存的原理与方法：在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，引起细胞死亡。向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存(zhcn)在-130以下的低温中能减少冰晶的形成。2、细胞复苏的原理与方法：细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的50，细胞仍能生长，活力受损不大。目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘
8、油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。,第二十页，共七十五页。,细胞(xbo)冻存罐,第二十一页，共七十五页。,第二节 免疫细胞膜分子(fnz)的检测,一、免疫细胞膜分子(fnz)检测的原理与类型二、免疫细胞膜分子的检测方法,第二十二页，共七十五页。,一、免疫细胞膜分子检测(jin c)的原理与类型,1、以抗体识别(shbi)抗原2、以配体识别受体,第二十三页，共七十五页。,二、免疫(miny)细胞膜分子的主要检测方法,1、免疫标记检测(jin c)方法 荧光抗体法 酶免疫检测法 免疫金银染色法2、补体依赖的细胞毒试验（CDC）3、花环形成试验,第二十四页，共七十五页。,SmI
9、g的荧光(ynggung)抗体检测法,第二十五页，共七十五页。,SmIg的酶免疫检测法,第二十六页，共七十五页。,补体(bt)依赖的细胞毒试验（CDC）,染料(rnlio),补体(bt),第二十七页，共七十五页。,E-花环(hu hun)：利用T细胞膜上的异种动物红细胞受体,T细胞(xbo),B细胞(xbo),花环形成细胞,绵羊红细胞,第二十八页，共七十五页。,第二十九页，共七十五页。,EA-花环：B淋巴细胞表面有Fc受体，能与免疫球蛋白的Fc段结合(jih)，因此用抗体致敏的红细胞与B淋巴细胞混合，可见B淋巴细胞周围粘附有红细胞,第三十页，共七十五页。,EAC-花环：B淋巴细胞表面有补体(b
10、t)受体，在抗体致敏的红细胞中加入补体(bt)，可形成红细胞-抗体-补体复合物，再与B淋巴细胞混合，则可形成EAC玫瑰花环。,第三十一页，共七十五页。,第三节 免疫细胞(xbo)功能测定,一、转化、增殖试验二、细胞毒试验三、抗体形成试验四、细胞吞噬(tnsh)与杀伤试验,第三十二页，共七十五页。,1、淋巴细胞转化试验：刺激物分为非特异性（如植物血凝素、刀豆素A等）和特异性刺激因子（如抗原）；检测方法为形态学检测法和3H-TdR掺入法及MTT法等。2、混合淋巴细胞培养：混合淋巴细胞培养(MLC)或称混合淋巴细胞反应(MLR)常用于器官移植前的组织配型，以测定受体和供体主要组织相容性抗原(HLA抗
11、原)相容的程度。由于MLC中淋巴细胞接受同种异型抗原的刺激而发生活化、增殖，产生种类众多的细胞因子，促进NK、LAK和CTL等杀伤细胞(xbo)的分化，因此又是免疫调节研究中常用的实验模型。,一、转化(zhunhu)、增殖试验,第三十三页，共七十五页。,第三十四页，共七十五页。,放射性测定(cdng),3H-TdR,丝裂原（抗原(kngyun)）刺激,淋巴细胞转化(zhunhu)试验原理示意,小淋巴细胞在转化为原始母细胞过程中，合成DNA增加，能够吸收胸腺嘧啶核苷（3H）,第三十五页，共七十五页。,1、T细胞(xbo)介导的细胞(xbo)毒试验2、ADCC作用测定3、NK活性测定,二、细胞毒检
12、测(jin c)试验,第三节 免疫细胞(xbo)功能测定,第三十六页，共七十五页。,放射性测定(cdng),细胞毒试验(shyn)原理示意,靶细胞,效应(xioyng)细胞,分离上清,第三十七页，共七十五页。,2、K细胞(xbo)活性测定（ADCC活性测定）,动物机体有些免疫细胞，通过抗体依赖细胞介导的细胞毒作用（ADCC）杀伤靶细胞，如NK细胞、活化的T细胞、吞噬细胞等，这类细胞统称为K细胞。K细胞的活性不仅反映机体细胞免疫的能力，而且与体液(ty)免疫也有直接的关系。K细胞活性检测的方法有同位素释放试验法，溶血空斑法，细胞剥离法和靶细胞接合试验。仅介绍同位素释放法。,第三十八页，共七十五页
13、。,（1）原理(yunl),将靶细胞用51Cr标记后，再与特异性的IgG抗体结合，加入K细胞后即可发生ADCC效应，引起靶细胞的溶解并释放51Cr。用计数仪分别检测上清和细胞沉淀中的cpm，根据上清中释放的51Cr的多少，可判断(pndun)K细胞活性的高低。,第三十九页，共七十五页。,（2）方法(fngf),1、试验管：效应细胞(淋巴细胞悬液)，标记的靶细胞(Cr51标记的鸡红细胞)和亚凝集单位的抗体(兔抗鸡红细胞抗体)各0.1ml，加RPMI 1640完全培养基1.7ml（ADCC）。2、效应细胞对照管：效应细胞和标记的靶细胞各0.1ml加上述完全培养基1.8ml（未加抗体）。3、抗体对照
14、管：标记的靶细胞和亚凝集单位的抗体各0.1ml，加完全培养基1.8ml（未加效应细胞）。4、最大释放对照管：标记的靶细胞0.1ml 加蒸馏水 1.9ml（靶细胞会裂解，完全释放同位素）。5、自然释放管：标记的靶细胞0.1ml，加完全培养基1.9ml（靶细胞不裂解，但可自然释放一定量的同位素）。以上(yshng)各管均置37520h后，2500g离心10min，分别取各管上清夜1.0ml置于5支试管中，用计数仪测各管上清和沉淀中的cpm值。,第四十页，共七十五页。,（3）结果判断(pndun)和计算,51Cr实验释放(shfng)率（%）2(上清cpm本底cpm)100%(上清cpm-本底cpm
15、)(沉淀cpm-本底cpm)51Cr 特异释放率（%）试验释放率自然释放率 100%最大释放率自然释放率,第四十一页，共七十五页。,3、NK细胞(xbo)活性测定,NK细胞是具有天然杀伤靶细胞活性的淋巴样细胞，其杀伤作用(zuyng)不需要抗体、补体的参加，所杀伤靶细胞通常指肿瘤细胞和病毒感染或转化的细胞。这样，可以将来源于同种动物的肿瘤细胞系或病毒转化的细胞系，作为检测NK细胞活性的指示细胞。NK细胞活性测定多采用51Cr释放法试验，其原理同细胞毒性T细胞试验中所采用的51Cr释放法试验。在这里以检测小鼠脾脏NK细胞活性为例，说明本试验方法。用3H-TdR掺入法，靶细胞为YAC-1细胞株（小
16、鼠淋巴瘤细胞系）。,第四十二页，共七十五页。,（1）试剂 小鼠脾细胞悬液:分离单个脾脏细胞-裂解(li ji)红细胞-淋巴细胞洗涤配置悬液（1640完全培养基2106/ml）。标记的靶细胞：活淋巴细胞（96%以上）加入H3-Tdr-孵育2小时/每30min振摇-洗3次-配成2106/ml悬液。,第四十三页，共七十五页。,（2）方法 试验组孔：脾细胞悬液(淋巴细胞)：标记的靶细胞悬液100:1左右；对照组：单纯加标记的靶细胞。37 5%CO2培养18小时（NK细胞杀伤靶细胞）；每孔加终浓度为0.15%的胰酶和0.0125%DNA酶37处理30min（消化细胞和处理掉死亡(swng)靶细胞释放出来的放射性DNA）。各孔细胞收集后依次通过生理盐水，5%三氯乙酸和无水乙醇（获得了存活的靶细胞的标记DNA）。待滤膜干燥后用液闪计数仪测定cpm值。三、结果计算 NK细胞活性以特异性杀伤率表示：特异性杀伤率（%）（1试验组cpm/对照组cpm）100%,第四十四页，共七十五页。,1、直接溶血空斑试验(shyn)2、间接溶血空斑试验3、SPA-SRBC溶血空斑试验,三、抗体(kngt)形成试验,第四十
