1、细胞(xbo)免疫学检测（cellular immunoassay）一、淋巴细胞表面标志物检测(Assay of membran molecules for lymphocytes）,第一页，共七十页。,一、免疫(miny)细胞分离技术(Technic of separation for immunocyte)二、免疫细胞表面标志检测技术（Assay of membran molecules for）三、免疫细胞功能检测技术（Assay for Immunocyte Tuntion）四、细胞因子与黏附分子检测技术（Assay for Cytokine and Adhesion molecule
2、）,第二页，共七十页。,免疫系统(Immune system),免疫器官(qgun)(Immune Organs)免疫细胞(Immunocyte)免疫球蛋白(Immunoglobulin)主要组织相容性复合体(Major Histocompatibility Complex;MHC)细胞因子(Cytekine)白细胞分化抗原和粘附分子(Leukocyte Differentiation Antigen and Adhesion molecule),第三页，共七十页。,免疫(miny)细胞(immune cells),指:所有参与免疫应答或与免疫应答有关(yugun)的细胞包括T细胞、B细胞、N
3、K细胞、单核吞噬细胞、树突状细胞及其他细胞,第四页，共七十页。,免疫(miny)细胞分离技术(Separation of immunocytes),第五页，共七十页。,人外周血(peripheral blood)白细胞分离(fnl),一、原理(principle)：红细胞/白细胞比例不同（6001000）：1，密度不同，沉降速度不同。二、方法(method)：1、自然沉降法（直立静置RT3060min，紧贴红细胞层上的白膜层）2、聚合物加速沉降法（加某些高分子物使RBC凝集成串(chn chun)加速沉降，如明胶）,第六页，共七十页。,人外周血单个核细胞(xbo)（peripheral blo
4、od mononuclear cells，PBMC）的分离,加入(jir)对倍稀释的血液样本,水平式离心(lxn)20min时结果,第七页，共七十页。,聚蔗糖(zhtng)-泛影葡胺(ficoll-hypaque),(1.0770.001g/L),分离(fnl)人外周血淋巴细胞以密度为1.0770.001/g/L,第八页，共七十页。,Percoll混悬液(处理过的硅胶颗粒(kl)原液密度(density)为1.135g/L+等量PBS,高速离心(centrifugation)由下而上的逐减的连续密度梯度(density gradient)淋巴细胞纯度98%,单核细胞纯度78%流程长,步骤繁,成
5、本高,第九页，共七十页。,人外周血淋巴细胞(亚群)的分纯(purificcation),人外周血单个核细胞（PBMC）主含淋巴细胞,但混有单核细胞、粒细胞、红细胞和血小板等。淋巴细胞的分纯：（一）红细胞的去除（0.83%氯化铵、蒸馏水）（二）血小板的去除（离心、洗涤）（三）单核、粒细胞的去除（黏附去除，羰基(tn j)铁粉吞噬）（四）淋巴细胞亚群的分离,第十页，共七十页。,淋巴细胞亚群的分离(fnl),分离依据(yj)：1、淋巴细胞不同亚群其细胞表面标志（specific membrane molecule/surface marker）2、淋巴细胞不同亚群其细胞分化抗原（antigen of
6、 cluster differentiation；CD）分离方法：1、,第十一页，共七十页。,Precipitation of E rosette,Erythrocyte Rosette forming cell;ERFC The sueface of T lymphocyte contains the receptor(CD2)of sheep erythrocyte,which is called E receptor for short.T lympho-cytes can form E rosette with sheep erythro-cytes by its E receptor
7、.Lymphocytes+sRBC,centrifugation-T lympho-cytes(底)/B lympho-cytes（界面(jimin)）,第十二页，共七十页。,2、黏着性（理化）：B淋巴细胞易黏附聚酰胺纤维(xinwi)（尼龙纤维(xinwi)）表面，而T淋巴细胞则不易附着（例）尼龙棉柱分离 直接流出的是T淋巴细胞。3、免疫学：用特异性抗体并使其固相化，捕获具特定膜抗原的细胞（例）1、亲和板结合分离(affinity)2、免疫磁珠分离（immunomagnetic beads）3、流式细胞术分离(FCM),第十三页，共七十页。,第十四页，共七十页。,磁性(cxng)微珠(mag
8、netic beads):,磁性微珠是以金属离子为核心，外层均匀包裹高分子聚合体的固相颗粒。磁性微珠上既可标记针对某种细胞表面抗原的特异性抗体(kngt)（直接法）;也可标记羊抗鼠IgG抗体(kngt)(间接法），使分离细胞的范围大大扩大,第十五页，共七十页。,正选（positive selection）法：磁珠结合的细胞就是所要分离获得(hud)的细胞负选（negtive selection）法：磁珠结合不需要的细胞，游离于上清液的细胞为所需细胞一般而言，负选法比正选法的磁珠用量大,第十六页，共七十页。,评价(evalution)：免疫磁珠分离法具有高纯度（8099），高得率（9095）、高
9、细胞活性（99100%）的特点，仅次或相当于流式细胞仪（FACS）的分选效率。与FACS 相比，本方法操作(cozu)简单、省时、经济；可用做FACS分选前的预分离，以减少FACS所用时间。另外连续两次过柱分选可进一步提高分选细胞纯度，通常可达9599。,第十七页，共七十页。,注意事项（Attentions）,如果分离细胞用作培养，全过程在超净台中完成。分离柱一般只能一次应用，再用时分离效率降低。抗体包被(bo bi)磁珠和死细胞常有非特异性结合，因而分选前应去除死细胞；上分离柱前，充分振荡混悬细胞，打散细胞团块。用分离柱分选，应用真空抽滤水，减少水中气泡，使分离柱不被气泡阻滞,第十八页，共七
10、十页。,荧光(ynggung)激活细胞分离仪原理(principle)（fluorescence activated cell sorter，FACS）,细胞经荧光染色后，通过高速流动系统，细胞排成单行，逐个流经检测区。当细胞从流动室喷嘴处流出时，超声振荡搅动液流，使液流断裂成一连串的均匀小滴，每小滴内最多含一个细胞（其中只有百分之几的液滴中含细胞）。细胞经激光照射产生荧光和散射光，信号经计算机系统处理(chl)，分辨细胞的类型。如识别的是所需的细胞时（如T细胞），使液滴瞬即感应阳电荷、阴电荷或不带电荷，使所需的细胞在电场偏转下进入不同的收集管。,第十九页，共七十页。,评价(evalution
11、)：用FACS分离细胞准确(zhnqu)快速、纯度高、回收率高，能保持细胞活力，并可在无菌条件下进行。仪器昂贵，极少用于常规，而多数仅作为研究的手段,第二十页，共七十页。,吞噬细胞(tn sh x bo)(phagocytosis)分离,Phagocytes-mononuclear macrophage neutrophil、eosinophil、basophil分离（Separation）：Mononuclear 参照(cnzho)Percoll分层液法 Macrophage 斑蝥敷贴（诱发无菌性皮炎）Other 很少分纯,第二十一页，共七十页。,树突状细胞(xbo)（Dendritic c
12、ell）,Dendritic cells（DCs）are the most potent antigen presenting cell（APC）known，which have numerous specialized features that make them extremely efficient at capturing and presenting antigen and activating T cells and mediating immune response.树突细胞是体内功能最强的专职(zhunzh)抗原提呈细胞，可把抗 原特异性地提呈给T淋巴细胞而产生抗原特异性免疫
13、应 答。,第二十二页，共七十页。,树突状细胞(xbo)（Dendritic cell）制备,DCs can be generated，in vitro，from many different samples of human beings.DCs only constitue 0.51.0%of the peripheral blood mononuclear cells.DCs can be generated from monocyto/M+IL-4 and GM-CSFIdentifing DCs by CD marker,第二十三页，共七十页。,免疫细胞功能(gngnng)检测(Ass
14、ays for immunocytes)一、功能简介二、测定方法,第二十四页，共七十页。,T lymphocytes,外周血中T细胞占淋巴细胞总数的65%70%来源于骨髓干细胞（胚胎期为卵黄囊和胎肝，Bone-marrow stem cells），在胸腺中发育和分化(fnhu)。分化成熟（be derived）后离开胸腺进入外周免疫器官的胸腺依赖区定居。淋巴细胞再循环(recycle)（血液组织淋巴血液）,第二十五页，共七十页。,T细胞(xbo)亚群（Subset）,根据TCR不同分为T细胞(xbo)和T细胞根据表面标志和分化抗原的不同，T可分为CD4和CD8 T细胞CD4 T细胞根据其分泌的
15、细胞因子和介导的功能在分为Th1和Th2CD8 T细胞依据其功能不同分为细胞毒性(cytotoxicity)T细胞和抑制性(suppresion)T细胞NK 1.1 T细胞专一识别脂类(lipid)抗原、非MHC限制,第二十六页，共七十页。,Type-I/2 T helper（Th1,Th2）,Th1细胞主要分泌IL-2、IFN-和TNF-，介导细胞免疫Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10，介导体液免疫Th1和Th2是一对重要的调节(regulation)细胞，同时又互为抑制(inhibition)细胞，二类细胞的相互(xingh)平衡(balance)与否直接影响(in
16、fluence)机体的免疫功能,第二十七页，共七十页。,T-cytotoxic cells,Tc/CTL（1）,CD8+T细胞免疫应答的主要效应(effect)细胞特异性杀伤(shshng)靶细胞(target cells)在肿瘤免疫和抗病毒感染的免疫中发挥重要作用功能发挥受MHC I类限制,第二十八页，共七十页。,Tc/CTL（2）,除细胞毒效应外，CTL还可分泌一系列细胞因子，调节(tioji)(regulation)免疫功能；也分泌趋化性(tend to)细胞因子如IL-8、IP-10（IFN inducible protein 10）、IP-1（巨噬细胞炎症蛋白）等，介导炎症反应(inflammatory reaction)。依据CTL分泌细胞因子的不同可分为Tc1和Tc2。,第二十九页，共七十页。,T-suppresion cells,Ts,通过过继转移实验(passive transfer test)加以确认(confirm)。可能(may be)作为单独的功能细胞群体存在(cnzi)多年来未能找到Ts特有（specific）的表面标志（surface marker）。,第
