1、流式细胞术及其科研(k yn)应用,第一页，共一百零五页。,流式细胞仪的原理(yunl),第二页，共一百零五页。,流式细胞术的基本概念,流式细胞术（Flow Cytometry,简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性，并加以定量的技术，同时可以对特定群体加以分选研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成(rn n h chn)微球等研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量,第三页，共一百零五页。,流式细胞术的特点(tdin),极短时间内可分析大量(dling)细胞，只要标本中的细胞数量足够，流式细胞仪（Flow cytometer）
2、可以每秒钟数十、数百、数千个细胞的速率进行测量，测量的细胞总数可达数千、数万乃至数百万个。可同时分析单个细胞的多种特征，当同时用多种分子探针，如用不同荧光素标记的不同单克隆抗体进行多色荧光染色，通过流式细胞分析，即可获得单细胞的多种信息，使细胞亚群的识别、计数更为准确。定性或定量分析细胞：通过荧光染色对单细胞的某些成分如DNA含量、抗原或受体表达量、Ca2+浓度、酶活性以及细胞的功能等均可进行单细胞水平的定性与定量分析 强大的分选功能，在分析的同时可以对特定群体加以分选,第四页，共一百零五页。,流式细胞仪的检测(jin c)范围,细胞(xbo)结构细胞大小细胞粒度细胞表面面积核浆比例DNA含量
3、与细胞周期RNA含量蛋白质含量,细胞功能细胞表面/胞浆/核的特异性抗原(kngyun)细胞活性细胞内细胞因子酶活性激素结合位点细胞受体,第五页，共一百零五页。,当前(dngqin)流式细胞分析发展趋势,从相对(xingdu)细胞计数到绝对细胞计数 从相对定量到绝对定量分析从单色到多色荧光分析 从细胞膜成分到细胞内成分分析从细胞分析到可溶性成分的流式细胞分析,第六页，共一百零五页。,散射光信号(xnho),Right Angle Light Detector Cell ComplexitySSC,Forward Light Detector Cell Surface Area FSC,Incid
4、ent Light Source,前向角散射光（FSC,Forward Scatter）细胞相对大小(dxio)及其表面积 侧向角散射光（SSC,Side Scatter）细胞粒度及细胞内相对复杂性,Laser,FALS Sensor,第七页，共一百零五页。,外周全血细胞散射光双参数(cnsh)点图（红细胞溶解后）,第八页，共一百零五页。,流式细胞仪的检测(jin c)信号,荧光信号使用荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析荧光信号的强弱(qin ru)，反映了细胞抗原的表达含量,第九页，共一百零五页。,荧光(ynggung)信号,双色直接(zhji)染色,第十页，共一百零五页。,数据分析,直方
5、图分析(fnx),第十一页，共一百零五页。,数据分析,点图分析(fnx),第十二页，共一百零五页。,数据分析,等高图和密度(md)图分析,第十三页，共一百零五页。,数据分析,三维图分析(fnx),第十四页，共一百零五页。,流式细胞仪的应用(yngyng),第十五页，共一百零五页。,临床研究:血液、肿瘤、药理、免疫(miny).生物学研究：遗传、生殖、微生物、细胞生物、毒理、分子生物、.环境研究：海洋生态研究.制药工业食品工业农业畜牧业,流式细胞仪的应用领域,第十六页，共一百零五页。,流式细胞仪的临床(ln chun)应用(免疫),淋巴细胞免疫分型淋巴细胞亚群分析CD4绝对计数HIV的诊断与研究
6、淋巴细胞 CD4/CD8分析CD4绝对计数T细胞活化细胞移植的交叉配型和免疫状态监测免疫功能和免疫调控(dio kn)的研究淋巴细胞和单核细胞的活化检测细胞因子的检测HLA-B27检测,第十七页，共一百零五页。,流式细胞仪的临床(ln chun)应用(血液),白血病和淋巴瘤免疫分型残留白血病造血干细胞计数PNH诊断网织红细胞分析血小板分析血小板膜糖蛋白分子的表达(biod)血小板活化网织血小板分析,第十八页，共一百零五页。,流式细胞仪的临床(ln chun)应用(肿瘤),细胞周期分析DNA非整倍体的出现可能是癌前病变发生早期癌变的一个重要标志在L&L病理形态学不能做出诊断前可提供确切诊断信息D
7、NA非整倍体的交界瘤应按恶性(xng)对待形态学表现良性的肿瘤出现非整倍体提示恶变可能DNA指数可作为判断间叶组织肿瘤良恶性的辅助指标多药耐药基因的检测,第十九页，共一百零五页。,流式细胞仪的科研(k yn)应用,树突细胞(xbo)研究干细胞研究细胞凋亡细胞动力学功能研究环境微生物分析流式细胞术与分子生物学研究,第二十页，共一百零五页。,淋巴细胞亚群分析(fnx),根据(gnj)功能，淋巴细胞主要分为B淋巴细胞（CD19+），与体液免疫有关T淋巴细胞（CD3+），与细胞免疫有关总T和总B可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病 NK细胞（CD3-CD16+56+），行使免疫监控功能，能够介导对
8、某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性作用。,第二十一页，共一百零五页。,淋巴细胞亚群分析(fnx),根据CD4、CD8表达，T淋巴细胞又分为T辅助/诱导细胞（CD3+CD4+）T抑制/细胞毒性细胞（CD3+CD8+）Th/Ts 评价那些自身免疫失调或被怀疑是免疫失调或已知患有免疫缺陷的病人的免疫状态，此外，这一比值还可用来监测骨髓移植病人以免受到急性GVHD的攻击 Th/Ts升高：自身免疫性疾病（类风湿性关节炎、SLE）Th/Ts降低(jingd)：病毒感染、恶性肿瘤、再生障碍性贫血,第二十二页，共一百零五页。,常见疾病的T 淋巴细胞的变化(binhu)：,疾病 CD4+CD8+CD4+/CD
9、8+类风湿性关节炎（活动期）系统性红斑狼疮-或（活动期）多发性硬化症 重症肌无力 膜型肾小球肾炎 胰岛素依赖性糖尿病 乙型肝炎 自身溶血性贫血(pnxu)上呼吸道感染,第二十三页，共一百零五页。,常见疾病的T 淋巴细胞的变化(binhu),CD3+CD4+CD8+CD4+/CD8+肿瘤(zhngli)再障及粒细胞减少症 巨细胞病毒感染 血小板减少 活动性特应性皮炎 过敏性皮炎,第二十四页，共一百零五页。,淋巴细胞亚群双色分析(fnx),12%,76%,49%,26%,11%,第二十五页，共一百零五页。,AIDS 病人(bngrn)T亚群分析,27-51%,15-44%,50-84%,第二十六页
10、，共一百零五页。,先天性无 r 球蛋白血症,5-18%,第二十七页，共一百零五页。,淋巴细胞活化(huhu)功能研究,第二十八页，共一百零五页。,T淋巴细胞活化(huhu),细胞数目增殖细胞表面表达(biod)活化标记分泌细胞因子,第二十九页，共一百零五页。,T细胞激活抗原表达(biod)的动力学曲线,第三十页，共一百零五页。,活化(huhu)的淋巴细胞分泌细胞因子,第三十一页，共一百零五页。,FastImmune Assay System快速全面检测(jin c)淋巴细胞功能,第三十二页，共一百零五页。,BD FastImmune Activation System快速(kui s)免疫活化
11、检测系统,第三十三页，共一百零五页。,BD FastImmune Activation System快速(kui s)免疫活化检测系统,第三十四页，共一百零五页。,应用(yngyng)实例：HIV病例T细胞活化检测,第三十五页，共一百零五页。,BD FastImmune Cytokine System快速免疫(miny)细胞因子检测系统,Activation 37 Incubation,Intracellular Stain,Lyse/Fix,Acqusition,Permeabilize,lymphocyte,erythrocyte,stimulus,Surface Stain,Wash,c
12、ytokine,Wash,Wash,protein blocking,基于细胞水平(shupng)的研究胞内因子胞外因子,第三十六页，共一百零五页。,BD FastImmune Cytokine System快速(kui s)免疫细胞因子检测系统,第三十七页，共一百零五页。,应用实例：分析1型与2型免疫(miny)反应,第三十八页，共一百零五页。,Cytometric Beads Array(CBA)流式液相多重蛋白定量(dngling)技术,第三十九页，共一百零五页。,导言(doyn),常规的蛋白分析方法：ELISA：一次反应只能检测一个指标Western blot：不能对蛋白精确定量不足之
13、处：检测多个指标需耗费大量样本分批操作导致组间差异大操作繁琐，耗时耗力如何(rh)能够从单个微量样本中一次检测多个目标蛋白，并加以定量，获得高精确度的数据呢？针对于此，BD-Pharmingen成功研发了基于流式细胞仪检测平台的液相多重蛋白定量技术BD Cytometric Bead Array，简称CBA,第四十页，共一百零五页。,CBA技术(jsh)简介,CBA是一系列带有不同强度红色荧光、包被有捕获抗体的微球，类似ELISA的捕获孔板，可以捕获液相样本（血清、血浆或者细胞培养上清液等）中相应的抗原，再结合(jih)PE标记检测抗体，形成双抗体夹心结构，通过流式细胞仪进行荧光检测，便可同时
14、对样本中的多种可溶性蛋白成分进行定量,+,+,Analyte of interest,Fluorescent detection Ab,capture Bead,capture Ab,Bead,第四十一页，共一百零五页。,BD Cytometric Bead Array,1,2,3,不同强度红色荧光(ynggung)的捕获微球，在FCM FL3检测,不同的目标(mbio)蛋白,PE 标记的检测抗体，在FCM FL2检测。PE的荧光强度即反映靶蛋白(dnbi)的含量,4,5,6,第四十二页，共一百零五页。,Human Th1/Th2 Lymphokine CBA,第四十三页，共一百零五页。,Hu
15、man Th1/Th2 Lymphokine CBA,Th1/Th2 panel:IL2,IL4,IL5,IL10,TNF,IFN用 FL3荧光(ynggung)的强度不同区别 种不同的微球（beads）Direct sandwich immunoassayFL2(PE)detector reagent样本处理6 cytokines from a 50 L sampleThree pipetting steps3 hour total incubationQuantitative results and complete report generationSoftware assisted q
16、uantitative analysis,with curve fitting algorithmResult reporting included in software,第四十四页，共一百零五页。,Human Th1/Th2 Lymphokine CBA,第四十五页，共一百零五页。,Human Th1/Th2 Cytokine CBA Kit,No sample added inDetector antibodies only,第四十六页，共一百零五页。,Chemokine-I CBA Assay Standard,0 pg/ml,CBA Assay Standard,第四十七页，共一百零五页。,10 pg/ml,CBA Assay Standard cont.,Chemokine-I CBA Assay Standard,第四十八页，共一百零五页。,20 pg/ml,CBA Assay Standard cont.,Chemokine-I CBA Assay Standard,第四十九页，共一百零五页。,40 pg/ml,CBA Assay Standard cont.,Chem
