1、北方园艺 （）：研究论文第一作者简介：闫浩浩（），男，博士研究生，研究方向为 植 物 病 害 病 原 物 分 离 鉴 定 与 防 治。：责任作者：李春艳（），女，博士，教授，博士生导师，现主要从事植物病害病原物分离鉴定与防治等研究工作。：基金项目：国家自然科学基金资助项目（）。收稿日期：蓝靛果叶斑病病原高粱附球菌（）分离鉴定及生物学特性闫 浩 浩，米 耀 族，桑 明 玉，臧 海 莲，李 春 艳（东北农业大学 资源与环境学院，黑龙江 哈尔滨 ）摘要：以黑龙江省哈尔滨市香坊区采集的蓝靛果发病植株为试材，通过病原菌分离培养、致病性测定、形态学鉴定和 、和 序列分析，确定其分类地位，以期为将来实施有效
2、的化学和生物防治提供重要病原菌株来源。结果表明：该病原菌为高粱附球菌（），可在 、和 培养基上生长，最适培养基为。最适培养条件为生长温度 ，碳源为乳糖和葡萄糖，氮源为牛肉膏，并且全光照条件有利于菌丝生长。关键词：蓝靛果；叶斑病；高粱附球菌；分离鉴定；生物学特性中图分类号：文献标识码：文章编号：（）蓝靛果（）是一种忍冬科忍冬属落叶灌木，其果实具有较高的营养价值，富含酚类化合物、花青素、有机酸、维生素和矿物质等，具有抗癌、抗氧化、保肝、抗肥胖、保护皮肤、抗糖尿病等功能，被称为“第三代小浆果之王”。其植株也能开发为生物饲料资源和茶叶等功能性产品。另外，蓝靛果在园艺、药用和植物系统发育中具有十分重要的
3、地位，越来越受到科学界的广泛关注。蓝靛果栽培时间可追溯到 年，目前在多个国家均有种植，如中国、俄罗斯、日本、美国、加拿大、波兰、斯洛伐克共和国、捷克共和国、芬兰、白俄罗斯、立陶宛和斯洛文尼亚等。随着世界范围内的种植面积呈上升趋势，蓝靛果病害的发生与蔓延已严重威胁到果实的产量和品质。目前，我国蓝靛果种植面积已达 ，国内对蓝靛果植株的研究主要集中在种质资源、杂交育种、苗木繁殖、引种栽培和栽培生理等方面，主要栽培品种有“蓝精灵”“乌兰”“蔚蓝”“北华号”和“北日勒”等，而针对其病害研究开展较少。因此，该研究分离鉴定蓝靛果植株叶斑病病害病原菌，明确其生物学特性，对开展蓝靛果病害调查提供了参考资料，为实
4、施有效的化学和生物防治提供了重要的病原菌株来源，为下一步深入研究蓝靛果叶斑病害的发生和流行规律奠定了理论基础。材料与方法 试验材料供试植株为 年月在黑龙江省哈尔滨市香坊区采集的二年生“蓝精灵”蓝靛果发病植株，对病害特征进行拍照记录。试验方法采用组织分离法对蓝靛果病害病原物进行分离。选取具有明显叶斑病症状的蓝靛果叶片组织，取病健交界处，用 酒精浸泡，次氯酸钠浸泡 并用无菌水清洗。无菌纸干燥后，将组织接种至 培养基中，下黑暗培养。待分离组织处长出少量菌丝后，挑取边缘菌丝多次纯化备用。项目测定 病原菌形态学观察将纯化菌株接种于 平板上，避光培养，观察菌株形态特征。在倒置显微镜（，舜宇光学科技（集团）
5、有限公司）下观察分离的蓝靛果病原菌的产孢结构、分生孢子等形态。经取材、固定、冲洗、乙醇系列脱水、置换、干燥、粘样和镀膜等，将试验样品放入观察仓进行观察，拍照记录在扫描电子显微镜（）下成像结果。病原菌致病性测定使用 无菌打孔器将生长的病菌平板制成菌饼，放置在蓝靛果健康叶片、茎等部位；病菌孢子用无菌水稀释，浓度为 个，均匀喷雾于蓝靛果叶片，以喷雾无菌水的健康蓝靛果植株作为对照，观察病害发展并拍照记录病害特征，验证“柯赫氏法则”。病原菌分子生物学鉴定用无菌刀片刮取在 培养基上培养了的分离菌株菌丝 ，采用 柱式真菌基因组 抽提试剂盒提取分离菌株菌丝 。采用 （）、（）、（）和 （）进 行 序 列 扩
6、增。反 应 程 序：预变性 ；变性，退火，延伸，个循环；再延伸 。产物经琼脂糖电泳检测合格后，转交给生工生物工程（上海）股份有限公司测序。、和 序列在 数据库中初步比对。利用 软件中邻接法（）构建系统发育树。并将菌株 的 、和 基因或核酸序列上传至 数据库，获得相应的 登录号。病原菌生物学特性观察不同培养基处理：选用 、和 培养基，并在 下进行黑暗培养；不同温度处理：选用 培养基，置于、恒温培养箱中黑暗培养；不同 处理：选用 培养基，用 的 和 溶液调节，设置、和共个梯度，并在 下进行黑暗培养；不同氮源和碳源处理：选用察氏（）培养基为基础培养基，分别用相同质量的不同氮源或碳源化合物代替其中的硝
7、酸钾或蔗糖，并在 下进行黑暗培养；不同光照处理：选用 培养基，连续光照、连 续 黑 暗、（光）（暗）条 件 下 恒温培养。在测试不同生物学特性指标对病菌生长影响时，其它条件均保持一致，并设置次重复。数据分析采用 软件统计原始数据，使用 软件进行数据分析。结果与分析 蓝靛果叶斑病症状观察叶斑病病害感染首先出现在蓝靛果叶尖或边缘（图），叶斑为黄色，随后逐渐覆盖大面积的蓝靛果叶片最终导致叶片脱落。部分叶片枯卷且皱缩，病健交界尤为明显。蓝靛果叶斑病病原物鉴定 病原菌形态学鉴定从发病植株组织中分离出真菌菌株，命名为。其在 培养基上呈现白色（图）；分生孢子（）为长椭圆形或长卵圆形，单胞，无色，大 小 为（
8、）（）（图）。在扫描电子显微镜（）下观察到菌株 的菌丝光滑丛生（图）。根据形态学特征，初 步 将 菌 株 鉴 定 为 高 粱 附 球 菌（.），。病原菌致病性分析试验过程中，接种 孢子悬浮液染病后，均发现黄色病斑开始从蓝靛果叶片边缘侵染；孢子悬浮液染病 后，蓝靛果叶片黄色病斑面积逐步扩大，有的病斑占据蓝靛果叶面积一半以上（图）。此外，接种菌饼后，对蓝靛果植 物 茎 部（图 ）和 叶 片（图 ）完 成 了侵染。北方园艺月月（上上）图收集的蓝靛果病株 病原菌分子生物学鉴定菌株 基因或核酸序列与.、和 相似 度 为 （表）。将 菌 株 的 、和 基因或核酸序列上传至 数据库，获得了 登录号 、和 。
9、由图可知，菌株 和.菌种的相关基因均归为一类。因此，结合形态学鉴定、致病性试验结果和分子生物学特征，将菌株 鉴定为高粱附球菌（.）。注：生长在 培养基上；分生孢子（倒置显微镜）；菌丝（扫描电子显微镜）。：；（）；（，）图菌株 的形态学特征 图菌株（；和）对蓝靛果致病性试验 （；）表病原菌菌株 基因序列相关匹配信息 菌株 基因名称 基因登录号 参考序列 相似度 第第期期 北方园艺图菌株 基于 （）和 （）序列分析构建的系统发育树 （）（）（）病原菌生物学特性菌株 在 、和 培养基上 培养后，菌丝均在这种培养基中正常生长（图），且适宜在培养基上生长（图）。菌株 在 培养基中 培养后，在 时未见生长
10、（图），重新置于 中恢复生长；另外，菌株 在 培养基中 时生长最快（图）。菌株 在 培养基中，为、和时培养后，在 为时生长最快北方园艺月月（上上）图菌株 在 （）、（）和（）培养基生长 （），（）（）图不同培养基对菌株 菌丝生长速率的影响 注：；。：；图菌株 在不同温度条件下生长 （图）。由图 可知，病原菌株 均能在供试的种碳源培养基上生长，其中乳糖和葡萄糖最有图不同温度对菌株 菌丝生长速率的影响 注：；。：；图菌株 在不同 条件下生长 图 不同 对病原菌 菌丝生长速率的影响 利于菌株菌丝生长，且显著高于其它碳源处理。由图 可知，病原菌株 均能在供试的种氮源培养基上生长，其中牛肉膏最有利于菌株
11、菌丝生长，且显著高于其它氮源处理。病原菌第第期期 北方园艺图 不同碳源处理对病原菌菌丝生长的影响 图 不同氮源处理对病原菌菌丝生长的影响 株 在以硝酸钾和酵母粉为氮源的培养基上生长最慢，不利于菌丝生长，且显著低于其它氮源处理。由图 可知，全光照下最有利于菌株菌丝生长，其次为（光）（暗），再次为连续黑暗，说明光照条件对病原菌株生长影响明显。图 不同光照处理对病原菌菌丝生长的影响 讨论与结论该研究从感染叶斑病的蓝靛果植株上分离到株真菌菌株 。并采用形态学、分子生物学、基于扩增序列构建的系统发育树和致病性等试验方法，将蓝靛果叶斑病的致病菌 鉴定为高粱附球菌（.），对我国蓝靛果植物病害调查意义重大。此
12、外，在国内.病 原 菌 被 报 道 发 生 在 百 合、水 稻、芋、铁 皮石 斛、黄花菜、薰衣草 和 玉米 等植株上。因此，该研究进一步拓宽了高粱附球菌（.）的寄主范围。该研究分析了高粱附球菌（.）菌株 的 生 物 学 特 性，发 现 其 可 在 、和 培养基上生长，最适培养基为，最适生长温度为 ，最适 为，最适碳源为乳糖和葡萄糖，最适氮源为牛肉膏，并且全光照条件有利于菌丝生长。黄鈜琳等 在贵州省独山县茶 叶 上 分 离 的 高 粱 附 球 菌（.）在培养基上生长速率最快，在 上最适生长温度为 ，最适 为 ，碳素营养和氮素营养均可影响菌丝的生长；曾慧兰等 从龙牙百合上分离的.菌株最适合碳源为乳
13、糖，氮源为牛肉浸膏，温度为 ，全光照条件有利于菌丝生长。该研究结果与上述结果存在一定差异，推测与病原菌株高粱 附球菌（.）的生存环境条件有关。结合菌株 生物学特性，建议田间防范该叶斑病时应加强水肥管理，合理控制相关氮源肥料的引入，勤耕细作，以避免蓝靛果叶斑病的发生与蔓延。综上所述，该研究分离和鉴定蓝靛果叶斑病致病菌高粱附球菌（.）并明确了其生物学特性，为明确蓝靛果植株病害的发生规律奠定基础。接下来对蓝靛果病害进行科学防治，减少因叶斑病病害造成蓝靛果叶片以及果实产量和品质的损失。（致谢：感谢“农业农村部生猪养殖设施工程重点实验室”支持。）北方园艺月月（上上）参考文献霍俊伟，杨国慧，睢薇，等蓝靛果
14、忍冬（）种质资源研究进展园艺学报，（）：，（）：，（），：，：，：，（）：秦栋，霍俊伟，睢薇 蓝果忍冬品种蓓蕾引种与选育 中国果树，（）：，李红莉，龙作义，孙强，等蓝靛果忍冬杂交亲和力及杂交浆果性状分析种子，（）：苏雅，裴毅，何松燕，等 蓝果忍冬对盐胁迫的生理响应研究试验研究天津农林科技，（）：其其格，钟丽华，葛丽丽，等蓝靛果忍冬新品种 北华号园艺学报，（）：古丽江许库尔汗，阿依古丽铁木儿，孙雅丽，等不同蓝靛果忍冬品种对干旱胁迫的光合生理响应比较分析核农学报，（）：，（）：黄鈜琳，尹桥秀，江仕龙，等 茶叶斑病病原菌高粱附球菌（）的鉴定及生物学特性热带作物学报，（）：，（）：姜莉莉，孙守民，宗晓
15、娟，等 泰安市“香野”草莓采后主要病原菌的分离鉴定及精油抑菌效果评价中国生物防治学报，（）：曾慧兰，卢其能，曾鹏远，等百合叶尖干枯病病原菌的鉴定、生物学特性及其对杀菌剂的敏感性研究园艺学报，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（），（）：，（）：，（），：，（），（，）：（），第第期期 北方园艺北方园艺 （）：研究简报第一作者简介：姜岳丛（），男，硕士研究生，研究方向为蔬菜设施栽培。：责任作者：王丽萍（），女，博士，教授，现主要从事蔬菜设施栽培等研究工作。：基金项目：北京市农林科学院蔬菜研究中心改革与发展资助项目（）；北京市农林科学院青年科研基金资助项目（）。收稿日期：氯化钙溶
16、液对植物工厂生菜品质及干烧心病情的影响姜 岳 丛，佟静，王 丽 萍（河北工程大学 园林与生态工程学院，河北 邯郸 ；北京农林科学院 蔬菜研究所，北京 ；农业农村部华北都市农业重点实验室，北京 ）摘要：以“绿雅”生菜为试材，采用叶面喷施氯化钙溶液的方法，设置（）、（）、（）、（）、（）个浓度的氯化钙溶液处理，研究了不同浓度下对生菜品质以及干烧心情况的影响，以期为改善植物工厂中生菜干烧心严重的情况，提高生菜的产量品质提供参考依据。结果表明：喷施氯化钙浓度为 时生菜的各项品质均相对 有较为明显的提升，其中蛋白质含量以及可溶性糖含量均为所有处理最高；氯化钙对改善生菜干烧心影响效果显著，且随浓度增加干烧心率逐渐降低，但产量以及部分品质在浓度超过 后出现下降。综合分析得出，氯化钙溶液喷施浓度为 时对生菜的品质提升最大且显著改善了植物工厂内生菜干烧心病情。关键词：叶面喷施；氯化钙；生菜；品质；干烧心中图分类号：文献标识码：文章编号：（）生菜（）为叶用莴苣一种，属菊科莴苣属一二年生草本植物，是植物工厂内重要的作物，植物工厂是设施栽培的高级阶段，通过智能计算机和电子传感系统对植物生长的温度、湿度、光照、
