1、第三章 细菌的生长和遗传变异,第一页，共六十八页。,主要内容,3-1 细菌的生长及特性3-2 细菌的遗传与变异,第二页，共六十八页。,一、生长与繁殖的概念二、细菌生长的测定方法三、细菌的生长特性四、微生物膜的生长特性,第三页，共六十八页。,3-1-1 生长与繁殖,同化作用大于异化作用时，细胞质的量增加，表现在细胞体积或重量的不断增加，这种现象称生长。,生长一定程度后细胞分裂，这就是繁殖。,个体的生长和繁殖表达为群体的生长。微生物重量或数目的增加。群体生长个体生长个体繁殖,在微生物学中“只有群体的重复才有意义，因此“生长一般指群体生长。,第四页，共六十八页。,3-1-2 细菌的生长测定方法,计数
2、法直接计数法借助显微镜间接计数法平板计数,生长量测定法测定重量、体积、含氮量来反映细菌的生长,第五页，共六十八页。,一 计数法,1、直接计数法显微镜,涂片染色法：一定量样品涂布在载玻片上，染色后计数。滤膜染色法：一定量样品过滤到滤膜上，然后染色计数。比例计数法将能看出颗粒浓度的液体与待测菌液按一定比例混合后在显微镜下，测各自的数目。,第六页，共六十八页。,涂片染色法,1视野菌液(ml)(0.1ml 1cm2)*视野面积(cm2),第七页，共六十八页。,第八页，共六十八页。,计数器(血球计数板测定法,110-4 ml菌液,第九页，共六十八页。,数了80个小格中有120个细菌，样品中的细菌浓度是多
3、少？(120个80)400/110-4 ml=600104个/ml适用范围：测定个体较大的细菌或原生动物细菌个体假设太小、过多，由于每一小格中细菌层层叠加，相互遮挡，难以准确计数。,数数细菌或其他微生物或细胞数目，一般数165=80个小格，折算样品细菌浓度；,第十页，共六十八页。,滤膜染色法,一定量样品过滤到滤膜上，然后染色计数。需要知道滤液的体积和滤膜的面积。在显微镜下计数，方法相同。,第十一页，共六十八页。,比例计数法,比例样品菌液与等体积或成一定比例的血液混合，观测二者比例,如果平均每个视野中细菌数量/红血球的数量比例为5.5：1，那么细菌数量=？5.5400万个/m l=2.2107个
4、/mL样品,红血球数能看出(男性400500万个mL，女性350450万个mL)，平均400万个/mL,比例计数法将能看出颗粒浓度的液体与待测菌液按一定比例混合后在显微镜下，测各自的数目。特点：不要求记体积,第十二页，共六十八页。,DAPI:46-diamidino-2-phenylindole,dihydrochloride4,6-二脒基-2苯基吲哚,Measurement of total cell counts,全细胞染色法死活不分：DAPI染色，DTAF,DAPI:无毒性荧光染料，能够与DAN双链强力结合并产生荧光。采用358nm紫外光照射能发射明亮的蓝色荧光。,第十三页，共六十八页。
5、,5-DTAF:5-(4,6-dichlorotriazinyl)aminofluorescein,Measurement of total cell counts,全细胞染色法死活不分：DAPI染色，DTAF,第十四页，共六十八页。,有必要区分细菌的死活吗？,饮用水中卫生细菌学标准是TBC100个/mL平板计数的标准，如果我们采用染色显微镜检测技术对刚刚加氯消毒的饮用水进行检测，可能会发现细菌数量会远远超过100个/mL，是不是饮用水就是不合格的饮用水呢？,第十五页，共六十八页。,美蓝染色法酵母活细胞计数,活菌直接计数DVC，Direct Viable Counts,吖啶橙AO染色直接计数B
6、acLight染色直接计数法N.A.法CTC染色直接计数,第十六页，共六十八页。,吖啶橙AO染色直接计数AODC,吖啶橙染色直接计数法AODC：水样采集后迅速参加甲醛固定，甲醛最终浓度2%；取10mL固定后水样参加0.5mL0.2%吖啶橙Acridine Orange，Sigma公司染色12min.；将染色水样经滤膜孔径0.2m，直径25mm，黑色聚碳酸脂滤膜，Nuclepore公司过滤；过滤后将滤膜置于载玻片上，用落射荧光显微镜日本Nikon，EF-D型计数视野中发橙色或绿色荧光的菌体；显微镜光源为200W汞灯，激发光滤光片为450490nm，光束别离滤光片510nm，阻挡滤光片520nm。
7、,吖啶橙染色，在紫外显微镜下观察细胞的荧光,AODC,第十七页，共六十八页。,BacLight染色直接计数法(一种核酸探针),BacLight染色直接计数法：将试剂按照产品要求配制后，取2mL固定后水样参加60L所配BacLight染色试剂，避光培养1520分钟；然后按照AODC处理方法制片，观察计数视野中发红色或绿色荧光的菌体。所用滤光片波段同AODC相同。镜检计数视野中发绿色荧光的菌体 为活菌。,BacLight,第十八页，共六十八页。,N.A.法,向水样中参加0.002%萘啶酮酸NA，Nalidixic Acid，Fluka公司和0.025%酵母膏均为最终浓度，避光，25培养6h，然后2
8、%甲醛固定，再按照AODC法直接镜检计数。视野中长大或变粗的菌体被认为是活菌。,N.A.,第十九页，共六十八页。,CTC染色直接计数活菌计数,将0.2mL1.67%的CTC参加10mL水样中CTC最终浓度1mM，避光室温培养4h，然后2%甲醛固定，再按照AODC法直接镜检计数视野中的红色菌体。,CTC,第二十页，共六十八页。,双重染色,10m,DTAF和CTC双重染色法,第二十一页，共六十八页。,FISH荧光原位杂交法Fluorescence In situ hybridization 16sRNA的碱基组成设计特异的探针probe,第二十二页，共六十八页。,FISH法的步骤,rRNA,萤光标
9、示探针(Probe),渗透,Hybridization,萤光显微镜观察、计数,細胞,第二十三页，共六十八页。,10m,FISH法,DTAF染色,土壤中微生物的测定,细菌,同视野,第二十四页，共六十八页。,2、间接计数法一种活菌计数法,平板计数法：描述：CFUcolony formation unit/mL将一定体积的菌液，均匀涂布在固体培养基上例如水中细菌总数采用的营养琼脂培养基，一定温度下培养，计数平板形成的菌落，一个菌落代表一个细菌。计数活细菌，死细菌不能够生长注意：一般可培养的微生物很少，计数结果与采用显微镜直接计数的结果差几百倍，甚至千、万。,第二十五页，共六十八页。,第二十六页，共六
10、十八页。,稀释平板计数法固体培养法,菌样被无菌水不同稀释倍率后平板培养图,第二十七页，共六十八页。,无菌水,稀释平板计数法固体培养法,第一步：菌样巧妙稀释,得到不同稀释度 10-x菌液,第二十八页，共六十八页。,各取1ml，均匀涂布于冷固体培养基平板上或与温热液态固体培养基混合冷却。,第三步：培养,稀释度过低，菌落密集无法计数,可以计数，但数量过多，费时费力,数量适宜，统计计算，作为结果,数量太少，误差因素太大，不做计数,第二步：接种平板,每一个细菌会生成一个菌落,一般计数平板的细菌生长菌落数以30300个为宜。,第二十九页，共六十八页。,第四步：计数,细菌数量=？细菌数量=数出的菌落数/稀释
11、度例如：10-5稀释度时菌落数为125个细菌数量=125/10-5=1.25107个/mL 平板计数法是采用最广的一种活菌计数法如国标法水中细菌总数的测定。注意：作空白及取平行样23组均值减小误差,第三十页，共六十八页。,第三十一页，共六十八页。,2、间接计数法一种活菌计数法,滤膜法：过滤到滤膜上把膜放在固体培养基上培养，然后把滤膜贴到培养基上，细菌获得营养而生长，形成菌落。大肠菌群测定,第三十二页，共六十八页。,2、间接计数法一种活菌计数法,液体计数法MPN法，most probable number法最可能数法 特点：液体培养、统计学查表计数主要用于不能在平板培养基上形成菌落的菌 硝化菌、
12、反硝化菌、硫酸复原菌将菌接种于液体培养基，经过一段时间培养，采用一定的技术来检测是否有细菌生长。例如硫酸盐复原菌的检测是利用它们生长时产生的硫化亚铁黑色特征进行检测，按MPN法进行计数。,第三十三页，共六十八页。,1稀释,2稀释接种样品,在液体外表加一层无菌液体石蜡隔绝氧气,恒温37培养14天,记录变黑的试管情况,3培养,1ml,+9ml,培养基,提问：为什么有些试管变黑有些没有？,稀释程度、取样概率,第三十四页，共六十八页。,(4)统计查表计算,统计数量指标确实定根据不同稀释度变黑试管，得到三位数及其中最低稀释度取重复管数都有菌生长的最高稀释度的生长管数，为数量指标的第一位数字，后面两个稀释
13、度的生长管数后两位数提问：上例情况而言统计数量是几？320 10-4,第三十五页，共六十八页。,MPN三管法测数统计表个菌/毫升,水中大肠菌群、铁细菌、硝化菌、亚硝化菌也用这种方法进行数量统计。,上面例子中数量指标“320 对应的细菌最可能数为9.5个菌/毫升，最低稀释度为10-4，折算出样品中菌浓度为 9.5x 104个菌/毫升。,查MPN表,第三十六页，共六十八页。,二 测生长量法,1测体积：粗放的方法，离心或自然沉降后观察体积；,2测细胞干重：离心法、过滤法两种；105110C下枯燥后称重干重约为湿重的1020%,活性污泥浓度测定方法：,第三十七页，共六十八页。,细菌不完全透光，一定范围
14、内菌溶液的混浊度与菌数量成正比,3比浊法/光密度法 ODoptical density450660nm,可见光,第三十八页，共六十八页。,制标准曲线ODNo,测菌液浊度，查图表得出细菌数量,浊度仪或721分光光度仪,第三十九页，共六十八页。,5细胞含氮量 细菌含氮量12.5%、酵母为7.5%粗蛋白量6.25N量,6DNA、蛋白质 同一细菌所DNA和蛋白质的量相对稳定，所以可以测DNA、蛋白质。,7ATP、RNA可以反映活性微生物的量,8微生物醌类 1g细胞平均含1mol醌类。,第四十页，共六十八页。,3-1-3 细菌的生长特性,间歇培养Batch cultivation和生长曲线growth
15、curve 将少量细菌接种于一定量的液体培养基内，在一定条件下培养。培养过程不投加或取出任何东西。这种培养方式叫间歇培养。细胞量随时间的变化曲线称生长曲线。,第四十一页，共六十八页。,Fig.1 Bacteria growth with different phosphorus(03g/L)and 10gAOC/L,第四十二页，共六十八页。,总细胞数,细菌典型生长曲线,第四十三页，共六十八页。,第四十四页，共六十八页。,细菌生长曲线按细菌数目的对数绘制,第四十五页，共六十八页。,延滞期、缓慢期lag phase细菌特点：生长速率常数近于零 细胞形态变大，但根本不分裂 rRNA含量增高 合成代谢
16、较活泼,影响延滞期长短的因素：接种龄：种子inoculum处于什么生长期。、接种量：特别是X0/S0，即初期微生物浓度与基质浓度的比。,产生延滞期的原因：,缺乏分解新环境中有关基质的酶；缺乏充足的代谢中间产物。,底物特点：底物充足,第四十六页，共六十八页。,2指数期exponential phase 对数期、生长率上升阶段,细胞数量以指数形式增加的时间段。细菌 特点：生长速率最大，世代时间generation time最短 酶系活泼、代谢旺盛细胞进行平衡生长，体内各成分最为均匀,底物特点：底物充足，大量被细菌消耗，降解速率最高,第四十七页，共六十八页。,指数期数学描述,世代时间,n 世代数,第四十八页，共六十八页。,3稳定期stationary phase：恒定期、静止期、生长下降期,细菌特点：净增长速度为零,底物特点：,底物被大量消耗，不能够维持对数期细菌高生长速率所需要的有机物质，导致细菌生长率下降,出现稳定期的原因：,营养物尤其是生长因子耗尽 营养物比例失调 pH、DO、氧化复原电位的变化,第四十九页，共六十八页。,数学表达,生长下降阶段,S很低，其浓度对微生物影响大,即有机物分
