1、,第一页，共八十五页。,第二章 酶与细胞的固定化,固定化生物技术 通过化学或物理的手段将酶或游离细胞定位于限定的空间区域内，使其保持活性并可反复利用。,第二页，共八十五页。,1.酶是蛋白质，稳定性差热、酸碱、有机溶剂对其有影响。2.不能回收，也使产物中混杂酶蛋白。3.别离纯化困难。,游离酶的缺点：,第三页，共八十五页。,一、固定化酶和固定化细胞的定义及特点 1.固定化酶(immobilized enzyme)固定在载体上并在一定空间范围内进行催化反响的酶。,第一节 酶与细胞的固定化,第四页，共八十五页。,什么是固定化酶？,水溶性酶,水不溶性载体,水不溶性酶固定化酶,固定化技术,第五页，共八十五
2、页。,优点：(1)可提高稳定性。(2)能回收，易与产物别离，可反复使用。缺点：(1)存在扩散限制。适于催化小分子物质。(2)酶活性下降。,第六页，共八十五页。,2.固定化细胞immobilized cell 固定在载体上并在一定空间范围内进行生命活动生长、繁殖、新陈代谢的细胞。,第七页，共八十五页。,优越性：(1)降低本钱，省去酶的别离纯化工作;(2)既可作为单一酶，也可作为复合酶系 完成局部代谢过程。局限性：(1)细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副 产物。(2)细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制 作用。,第八页，共八十五页。,3.固定化原生质体 意义：(1)固定化原生质体去除了细胞壁的扩
3、散障碍，有利于氧的传递，营养成分的吸收和胞内产物的分泌。(2)原生质体不稳定，容易破裂，固定化后，由于载体的保护作用，稳定性提高。,第九页，共八十五页。,二、固定化方法,固定化方法,一酶的固定化方法,吸附法,共价偶联法,交联法,包埋法,网格型,微囊型,离子交换吸附,物理吸附法,第十页，共八十五页。,依据带电的酶或细胞和载体之间的静电作用，使酶吸附于惰性固体的外表或离子交换剂上。,1.吸附法adsorption,第十一页，共八十五页。,根据吸附剂的特点分:1物理吸附法physical adsortion作用力：氢键、疏水键常用载体：氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石、纤维素、活
4、性碳等。2离子结合法ion binding作用力：离子键常用载体：DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、CM-纤维素,第十二页，共八十五页。,优点：条件温和，操作简便，酶活力损失少。缺点：结合力弱，易解吸附。,第十三页，共八十五页。,借助共价键将酶的活性非必需侧链基团和载体的功能基团进行偶联。,2.共价偶联法covalent binding or covalent coupling,第十四页，共八十五页。,1载体：亲水载体优于疏水载体 如:天然高分子衍生物:纤维素 葡聚糖凝胶 亲和性好，机械性能差 琼脂糖 合成聚合物：聚丙烯酰胺 聚苯乙烯 机械性能好，但有疏水结构 尼龙,第十五页，共八十五页
5、。,2偶联方法：偶联成功与否取决于：载体：功能基团：芳香氨基，羧基，羧甲基等。酶分子:侧链非必需基团：羧基，巯基，羟基，酚基，咪唑基。,第十六页，共八十五页。,常用的偶联反响有：重氮化法、叠氮法、溴化氰法、烷基化法等。,第十七页，共八十五页。,优点：酶与载体结合牢固，不会轻易脱落，可连续使用。缺点：反响条件较剧烈，易影响酶的空间构象而影响酶的催化活性。,第十八页，共八十五页。,3.交联法crosslinking 借助双功能试剂使酶分子之间发生交联的固定化方法。双功能试剂：常用的是戊二醛 O OH C CH2 CH2 CH2 C H,第十九页，共八十五页。,戊二醛有两个醛基，均可与酶或蛋白质的游
6、离氨基反响,使酶蛋白交联。,此法与共价偶联法利用的均是共价键，不同之处：交联法不使用载体。,第二十页，共八十五页。,交联反响既能发生在分子间，也可发生在分子内。酶浓度低时，交联发生在分子内，酶仍保持溶解状态。酶浓度高时，交联发生在分子间，酶变为不溶态。,第二十一页，共八十五页。,缺点：(1)反响条件剧烈，酶分子的多个基团被交联，酶活力损失大。(2)制备的固定化酶颗粒较小，给使用带来不便。,第二十二页，共八十五页。,4.包埋法entrapment,将酶用物理的方法包埋在各种载体高聚物内。分为：网格型：将酶包埋在高分子凝胶细微网格中。微囊型：将酶包埋在高分子半透膜中。,第二十三页，共八十五页。,1
7、网格型包埋法gel(lattic)entrapment 又称凝胶包埋法,使用的多孔载体及其特点,第二十四页，共八十五页。,海藻酸钙凝胶包埋法：滴至海藻酸钠溶液E(or cell)CaCl2 溶液中 IE(or IC)角叉菜胶包埋法：滴至角叉菜胶E(or cell)KCl 溶液中 IE(or IC)聚丙烯酰胺凝胶包埋法：APAcr+Bis+E(or cell)IE(or IC)TEMED,第二十五页，共八十五页。,2微囊型包埋法microencapsulation 又称半透膜包埋法 将一定量酶液包在半透性的高分子微孔膜内。半透膜：直径几十微米到几百微米，厚约25nm。半透膜孔径酶分子孔径，小于半
8、透膜孔径的小分子底物和产物可以自由进出，被称为“人工细胞。,第二十六页，共八十五页。,与网格型包埋法相比，微囊型包埋法的优点：1固定化酶颗粒小，有利于底物和产物扩散。2半透膜能阻止蛋白质分子渗漏和进入，注入体内既可防止引起免疫过敏反响，也可使酶免遭蛋白水解酶的降解，具有较大的医学价值。缺点：反响条件要求高,制备本钱也较高。,第二十七页，共八十五页。,包埋法是目前应用最多的一种较理想的方法，与其它固定化方法相比：优点：不与酶蛋白氨基酸残基反响，很少改变酶的高级结构，酶活回收率高。缺点：只适合作用于小分子底物和产物的酶。,第二十八页，共八十五页。,第二十九页，共八十五页。,第三十页，共八十五页。,
9、第三十一页，共八十五页。,各种固定化方法的优缺点比较,第三十二页，共八十五页。,二细胞的固定化方法 1.固定化细胞的分类,第三十三页，共八十五页。,1)直接固定法 不使用载体，借助物理如加热、冰冻、化学方法如柠檬酸、各种絮凝剂将细胞直接固定。一般只用于单酶或少数几种酶催化的反响。2)吸附法 3)包埋法,2.固定化方法,第三十四页，共八十五页。,例如：葡萄糖异构酶(白色链霉菌)，是一种胞内酶。在50-80加热10分钟，使菌体自溶作用的酶失活，而葡萄糖异构酶仍然保持活性，长期使用酶活力不减少。,第三十五页，共八十五页。,第三十六页，共八十五页。,实验：2.4%左右的卡拉胶，70 溶解,再冷却到 4
10、2,+10%左右的细菌菌体(预热到42 迅速混合均匀 4 冰箱放置大约30min 取出后切成33mm的小颗粒,第三十七页，共八十五页。,一般采用网格包埋法即凝胶包埋法。常用凝胶：琼脂凝胶，海藻酸钙凝胶，角叉菜胶和光交联树脂。注意：一般要加渗透压稳定剂，以防止原生质体破裂。,三原生质体的固定化方法,第三十八页，共八十五页。,第二节 固定化酶和固定化细胞 的性质与表征一、固定化酶的性质 影响酶催化活性的因素 1.构象改变或立体屏蔽以及微扰 2.分配效应和扩散限制效应,第三十九页，共八十五页。,第四十页，共八十五页。,第四十一页，共八十五页。,一酶的活性：通常低于天然酶有例外。二酶的稳定性 酶的耐热
11、性、对变性剂、抑制剂、蛋白酶的抵抗力增加。,第四十二页，共八十五页。,可能的原因：固定化增加了酶活性构象的牢固程度，可防止酶分子伸展变形；抑制酶的自身降解。固定化局部阻挡了外界不利因素对酶 的侵袭。,第四十三页，共八十五页。,如：氨基酰化酶，70，15分钟，酶失去活性。而固定化后，70，15分钟，有80%活性。,第四十四页，共八十五页。,三酶的最适温度 最适温度与酶稳定性有关。多数酶固定化后热稳定性上升，最适温度也上升有例外。四酶的最适pH 带负电荷载体：最适pH 向碱性偏移。带正电荷载体：最适pH 向酸性偏移。,第四十五页，共八十五页。,第四十六页，共八十五页。,固定化酶的表观米氏常数Km随
12、载体的带电性能变化。固定化载体与底物电荷相反,固定化酶的表观Km值降低。固定化载体与底物电荷相同,固定化酶的表观Km值显著增加。,五酶的动力学特征,第四十七页，共八十五页。,与自然酶根本相同。但大分子底物难于接近酶分子，导致酶的专一性发生改变。,六酶的作用专一性,第四十八页，共八十五页。,与固定化酶相比，固定化细胞的情况比较复杂。1有活性升高的现象。2稳定性的增加。3最适温度和最适pH常保持不变。,二、固定化细胞的性质,第四十九页，共八十五页。,(一)酶(细胞)的活力 固定化酶通常呈颗粒状，一般用于测定自然酶活力的方法改进后才能用于测定固定化酶。(二)蛋白总量 1.双辛可宁酸法(BCA法)2.
13、考马斯亮蓝法,三、固定化酶细胞的评价指标,第五十页，共八十五页。,(三)偶联率及相对活力 偶联率=(参加蛋白活力一上清液蛋白活力)/参加蛋白活力100%活力回收=固定化酶总活力/参加酶的总活力100%相对活力=固定化酶总活力/(参加酶的总活力-上清液中未偶联酶活力)100%,第五十一页，共八十五页。,(四)半衰期 在连续测定条件下，固定化酶(细胞)的活力下降为最初活力一半所经历的连续工作时间，以t1/2表示。是衡量稳定性的一项重要指标。,第五十二页，共八十五页。,不同固定化方法的比较,第五十三页，共八十五页。,乙酰-DL Ala L Ala+乙酸乙酰-D Ala,第三节 固定化酶与固定化细胞的
14、应用 一、在工业生产上的应用 1.氨基酰化酶Aminoacylase 世界上第一种工业化生产的固定化酶,第五十四页，共八十五页。,第五十五页，共八十五页。,2.葡萄糖异构酶 世界上生产规模最大，应用最为成功的一种固定化酶。,第五十六页，共八十五页。,二、固定化酶在医学上的应用 1.消血栓：纤溶酶是异源蛋白质，在人体内引起免疫反响，无法长期使用。酶的不稳定性使其在较短的时间内失活。用包埋法制备的酶固定化技术可克服上述弊端，酶在囊中不能漏出，小分子物质能自由进出。,第五十七页，共八十五页。,2.人工肾：原理：将病人血液中的尿素经脲酶水解成氨，再用活性炭吸附。即：用固定化脲酶和微胶囊活性炭组成人工肾
15、。,第五十八页，共八十五页。,第五十九页，共八十五页。,酶传感器 固定化酶和电化学传感器的结合。优点：既有不溶性酶体系的优点，又具有电化学电极的高灵敏度；酶的专一反响性，使其具有较高的选择性，能够直接在复杂试样中进行测定。,三、在分析检测中的应用,第六十页，共八十五页。,Sensitive and specific Rapid Simple,Biosensor,第六十一页，共八十五页。,1967年Updike等采用酶的固定化技术，将葡萄糖氧化酶固定在疏水膜上，然后再和氧电极结合，组装成了世界上第一个生物传感器葡萄糖氧化酶电极。,第六十二页，共八十五页。,葡萄糖酶电极,酶电极示意图D葡萄糖O2
16、D葡萄糖酸1，5内酯H2O2,半透膜,酶胶层,感应电极,第六十三页，共八十五页。,Glucose,Gluconic acid,Glucose oxidase,Oxygen,Hydrogen peroxide,Membrane,Electrode,根据反响中消耗的O2、生成的葡萄糖酸和H2O2的量，可以用氧电极、pH电极和H2O2电极来测定葡萄糖的含量。,第六十四页，共八十五页。,继酶传感器enzyme sensor后，又出现：细胞器传感器cell organelle sensor组织传感器tissue sensor微生物传感器microbe sensor免疫传感器immunosensor,第六十五页，共八十五页。,1酶传感器的原理,生物传感器 由生物识别单元如酶、微生物、抗体等和物理转换器相结合所构成的分析仪器。,第六十六页，共八十五页。,第六十七页，共八十五页。,生物识别元件(Biological recognition element),是酶、抗原(体)、细胞器、组织切片和微生物细胞等生物分子经固定化后形成的一种膜结构，对被测定的物质有选择性的分子识别能力。,第六十八页，共八十五页
