1、RNA干扰抑制CD147表达对人胃癌细胞SGC7901增殖、侵袭和顺铂敏感性的影响,2022.5.18,王书奎 MD,PhD 南京医科大学附属南京第一医院,第一页，共四十九页。,报告内容,研究背景 研究目标 实验方法与结果 实验结论,第二页，共四十九页。,一、研究背景,第三页，共四十九页。,胃癌概况,胃癌最常见的恶性肿瘤之一，恶性肿瘤致死占第二位。其恶性程度较高，转移扩散严重，多数患者就诊时已属中晚期，因而死亡率较高。,第四页，共四十九页。,MMP简介,肿瘤的侵袭和转移是一个复杂的过程，其中细胞外基质和基底膜的降解是肿瘤转移过程中的重要步骤。这与细胞外基质金属蛋白酶extracellular
2、matrix metalloproteinase，MMP的参与密不可分。,第五页，共四十九页。,MMP是一个锌离子依赖的蛋白酶家族，目前已发现26种。MMP的主要功能是降解细胞外基质。肿瘤细胞利用MMP的基质降解能力迁移到其他部位。在肿瘤与间质交界处，MMP往往高表达。,第六页，共四十九页。,20世纪80年代，Biswas实验室从人肺癌细胞株LX-1的细胞膜上别离得到了一种58 kDa的糖蛋白，具有刺激成纤维细胞合成MMP-1的功能，将其命名为肿瘤胶原酶刺激因子tumor collagenase stimulating factor，TCSF。,第七页，共四十九页。,进一步研究说明TCSF不仅
3、能刺激MMP-1的产生，还能刺激MMP-2、MMP-3、MMP-9和MMP-11等的产生，因此将其重命名为细胞外基质金属酶诱导因子extracellular matrix metalloproteinase inducer，EMMPRIN)。第六届人类白细胞分化抗原协作组会议将EMMPRIN命名为CD147。,第八页，共四十九页。,CD147的结构,CD147属单次跨膜糖蛋白，胞外段中的4个半胱氨酸残基形成2个二硫键，构成2个典型的半球形Ig结构域。,第九页，共四十九页。,细胞内的CD147存在低糖基化 low glycosylated CD147，LG和高糖基化high glycosylat
4、ed CD147，HG形式，分子量分别是3244kDa、4565kDa。只有HG形式能刺激MMP的产生。,第十页，共四十九页。,CD147的功能,CD147是一种广泛表达于细胞外表，在体内分布广泛，参与精子发生、胚胎发育、肿瘤的侵袭和转移、炎症反响、病毒感染等多种生理和病理过程，是一个多功能的分子。,第十一页，共四十九页。,免疫组化实验证实CD147在多种恶性肿瘤中高表达，包括膀胱癌、皮肤癌、肺癌、乳腺癌、淋巴癌和胰腺癌等。并且肿瘤的恶性程度越高，CD147的表达水平也越高。,第十二页，共四十九页。,CD147在肿瘤发生开展中的作用,1.促进肿瘤的侵袭和转移 CD147就是通过刺激成纤维细胞及
5、肿瘤细胞本身产生多种MMP来降解基底膜和细胞外基质，从而促进肿瘤的浸润和转移的。,第十三页，共四十九页。,2.诱导肿瘤血管生成 血管内皮生长因子vascular endothelial growth factor，VEGF是很多情况下血管生成过程的主要调节因子，包括肿瘤形成过程。CD147可以诱导VEGF的表达。,第十四页，共四十九页。,3.促进肿瘤细胞多药耐药 在多种多药耐药的肿瘤细胞中都观察到CD147的高表达。CD147可激活PI3K/AKT细胞存活信号通路。在大多数恶性肿瘤细胞中此通路均被激活。,第十五页，共四十九页。,胃癌中CD147的表达,日本Toyama大学的Zheng HC等研
6、究说明：在正常胃黏膜开展为增生性或化生性胃黏膜，最后开展为胃癌的过程中，CD147的表达量是逐渐增加的，并且CD147的表达与肿瘤大小、浸润深度、淋巴结转移以及MMP-2、MMP-9和VEGF的表达呈正相关。,第十六页，共四十九页。,胃癌组织中CD147的表达,CD147在胃癌组织中高表达,第十七页，共四十九页。,二.研究目标,第十八页，共四十九页。,本实验旨在运用RNA干扰技术抑制胃癌细胞株SGC7901中CD147基因的表达，研究该基因沉默后对肿瘤细胞生长、侵袭能力及化疗药物敏感性的影响，探讨CD147在胃癌中的作用。,第十九页，共四十九页。,三、研究方法及结果,第二十页，共四十九页。,C
7、D147shRNA真核表达载体的构建与鉴定转染SGC7901细胞，筛选稳定表达干扰载体的SGC7901细胞株MTT法检测SGC7901细胞增殖水平的变化明胶酶谱法检测SGC7901细胞MMP-2、MMP-9分泌的变化SGC7901细胞体外侵袭力测定MTT检测SGC7901细胞顺铂敏感性的变化,技术路线,技 术 路 线,第二十一页，共四十九页。,胃癌细胞株SGC7901源自一位56岁女性胃腺癌患者的淋巴结转移瘤。研究说明其侵袭能力强，恶性程度高。我们前期研究说明，该细胞外表CD147是高表达的。,第二十二页，共四十九页。,shRNAshort hairpin RNA表达载体的构建,pSilenc
8、er3.1-H1 neo,第二十三页，共四十九页。,shRNA模板的设计示意图,第二十四页，共四十九页。,干扰靶序列的选择,参考陈翔等的报道，选取CD147mRNA 370-390和808-828作为靶序列，相应的shRNA分别命名为shRNA1和shRNA2。另外，设计一个阴性对照shRNA-control。,第二十五页，共四十九页。,RNAi靶序列在CD147 mRNA上的位置,1 AGCGGTTGGA GGTTGTAGGA CCGGCGAGGA ATAGGAATCA TGGCGGCTGC 51 GCTGTTCGTG CTGCTGGGAT TCGCGCTGCT GGGCACCCAC GGA
9、GCCTCCG 101 GGGCTGCCGG CACAGTCTTC ACTACCGTAG AAGACCTTGG CTCCAAGATA 151 CTCCTCACCT GCTCCTTGAA TGACAGCGCC ACAGAGGTCA CAGGGCACCG 201 CTGGCTGAAG GGGGGCGTGG TGCTGAAGGA GGACGCGCTG CCCGGCCAGA 251 AAACGGAGTT CAAGGTGGAC TCCGACGACC AGTGGGGAGA GTACTCCTGC301 GTCTTCCTCC CCGAGCCCAT GGGCACGGCC AACATCCAGC TCCACGGGC
10、C351 TCCCAGAGTG AAGGCTGTGA AGTCGTCAGA ACACATCAAC GAGGGGGAGA 401 CGGCCATGCT GGTCTGCAAG TCAGAGTCCG TGCCACCTGT CACTGACTGG 451 GCCTGGTACA AGATCACTGA CTCTGAGGAC AAGGCCCTCA TGAACGGCTC 501 CGAGAGCAGG TTCTTCGTGA GTTCCTCGCA GGGCCGGTCA GAGCTACACA 551 TTGAGAACCT GAACATGGAG GCCGACCCCG GCCAGTACCG GTGCAACGGC601 A
11、CCAGCTCCA AGGGCTCCGA CCAGGCCATC ATCACGCTCC GCGTGCGCAG 651 CCACCTGGCC GCCCTCTGGC CCCTCCTGGG CATCGTGGCT GAGGTGCTGG 701 TGCTGGTCAC CATCATCTTC ATCTACGAGA AGCGCCGGAA GCCCGAGGAC 751 GTCCTGGATG ATGACGACGC CGGCTCTGCA CCCCTGAAGA GCAGCGGGCA801 GCACCAGAAT GACAAAGGCA AGAACGTCCG CCAGAGGAAC TCTTCCTGAG 851 GCAGGTG
12、GCC CGAGGACGCT CCCTGCTCCA CGTCTGCGCC GCCGCCGGAG901 TCCACTCCCA GTGCTTGCAA GATTCCAAGT TCTCACCTCT TAAAGAAAAC 951 CCACCCCGTA GATTCCCATC AT,第二十六页，共四十九页。,设计好的shRNA插入序列,第二十七页，共四十九页。,2、CD147 shRNA表达载体的构建：,将合成的三对片段分别用水浴中加热后退火备用，与经BamH I和Hind III双酶切的pSilencer3.1-neo质粒连接，构建成CD147 shRNA表达载体，重组质粒分别命名为pSilencer-s
13、hRNA1，pSilencer-shRNA2 和pSilencer-shRNA-control。,第二十八页，共四十九页。,重组质粒测序鉴定结果,DNA测序说明，3个重组质粒构建正确。,pSilencer/shRNA1测序图（红线为插入片段）,第二十九页，共四十九页。,转染及筛选,脂质体转染48h后用含0.4g/ml的G418的完全培养基筛选2周，然后改为半量维持。将抗G418的阳性细胞克隆用有限稀释法别离出来并逐步扩增以待进一步分析。筛选出的细胞克隆分别命名为SGC7901/shRNA1，SGC7901/shRNA2和SGC7901/shRNA-control。,第三十页，共四十九页。,Re
14、al-time PCR检测CD147 mRNA表达水平,与SGC7901相比，SGC7901/shRNA1和SGC7901/shRNA2细胞中CD147 mRNA相对表达量分别下降至72.4%和17.3%。,第三十一页，共四十九页。,Lane 1:SGC7901.Lane 2:SGC7901/shRNA-controlLane 3:SGC7901/shRNA1Lane 4:SGC7901/shRNA2,HG代表高糖基化形式的CD147，LG代表低糖基化形式的CD147。Western blot结果与Real-time PCR结果相符。,第三十二页，共四十九页。,终止培养,抑制率(%)=(对照组
15、A 值-实验组A 值)对照组A 值100%,24h、48h、72h 时间点,MTT细胞增殖实验,第三十三页，共四十九页。,与SGC7901和SGC7901/shRNA-control相比，培养24h、48h、72h后SGC7901/shRNA2细胞增殖能力均显著降低.而阴性对照组SGC7901/shRNA-control增殖能力无显著改变。,第三十四页，共四十九页。,明胶酶谱法检测细胞上清中MMP-2和MMP-9的活性,明胶酶包括72 kDa的明胶酶A基质金属蛋白酶-2，MMP-2和92 kDa的明胶酶B(基质金属蛋白酶-9，MMP-9)。其作用底物为基底膜中的型胶原和变性的间质胶原明胶，其活
16、性与肿瘤细胞侵袭和转移能力密切相关。,第三十五页，共四十九页。,明胶酶谱法是一种测定明胶酶活性的常用方法。收集细胞培养上清液，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法可将这两种明胶酶按分子量大小分开，显示两条负染条带，根据条带的面积和亮度可判定明胶酶的活性。,第三十六页，共四十九页。,明胶酶谱结果,SGC7901/shRNA2细胞上清液中MMP-2和MMP-9的活性明显降低,第三十七页，共四十九页。,Transwell原理,Matrigel是从小鼠EHS肉瘤中提取的基质成分，含有层粘连蛋白、型胶原等。将Matrigel铺在Transwell侵袭小室的多孔滤膜上，能形成与天然基底膜极为相似的基底膜结构。,第三十八页，共四十九页。,Transwell结果,穿过Transfer侵袭小室的染成紫色的细胞400,第三十九页，共四十九页。,SGC7901/shRNA2细胞 体外侵袭能力显著降低,第四十页，共四十九页。,顺铂敏感性实验,抗肿瘤药物顺铂的使用浓度以血浆峰浓度 Peak Plasma Concentration，PPC)为标准。参照Sondak等的报道，顺铂的PPC为3.0 g/ml。本实验中使用
