1、细胞因子及免疫细胞功能检测(jin c)方法简介,刘素侠山东大学(shn dn d xu)医学院免疫学研究所2011-2-23,第一页，共一百一十五页。,内 容,细胞因子检测的常用方法免疫(miny)细胞功能的常用检测方法,第二页，共一百一十五页。,一、免疫学检测(jin c)的基本原理,抗原与抗体反应(fnyng)的特异性是各种免疫学检测技术的基本原理,第三页，共一百一十五页。,第四页，共一百一十五页。,二、细胞因子检测(jin c)方法,细胞因子的临床意义常规测定法 胞内细胞因子检测方法细胞因子检测的主要临床(ln chun)应用,第五页，共一百一十五页。,（一）细胞因子的临床意义,细胞因
2、子与疾病：正常情况下，细胞因子表达和分泌受机体的严格调控，在病理状态下细胞因子会出现异常性表达，表现(bioxin)为细胞因子及其受体的缺陷，细胞因子表达过高，以及可溶性细胞因子受体的水平增加等。细胞因子与治疗：重组细胞因子做为生物应答调节剂。已批准生产：IFN-、，Epo，GM-CSF，G-CSF，IL-2，正在进行临床试验的：IL-1、3、4、6、11，M-CSF，SCF，TGF-等,第六页，共一百一十五页。,（二）常规检测(jin c)方法,分子生物学测定法 生物(shngw)活性检测法 免疫化学测定法,第七页，共一百一十五页。,1.分子生物学测定法,是测定细胞因子mRNA的表达水平，主
3、要有两种方法：分子(fnz)杂交技术多聚酶链反应技术（PCR）,第八页，共一百一十五页。,分子杂交(zjio)技术,制备细胞因子的基因探针；Northern 杂交或细胞原位杂交；优点：高度敏感和高度特异；缺点：操作较繁琐 测定结果只能代表细胞因子基因的表达(biod)，而不能代表活性细胞因子的水平。,第九页，共一百一十五页。,多聚酶链反应技术(jsh)（PCR）,PCR（polymerase chain reaction)技术，是一种高效的基因体外扩增技术；将细胞因子产生细胞的RNA提取出来，再经逆转录合成cDNA，以cDNA为模板，在细胞因子引物的引导下，即可进行PCR扩增；优点(yudin
4、)：灵敏度高 操作简便缺点：测定结果只能代表细胞因子基因的表达，而不能代表活性细胞因子的水平。,第十页，共一百一十五页。,PCR原理(yunl),PCR是体外酶促合成特异DNA片段的方法。由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环(xnhun)进行，使目的DNA得以迅速扩增。由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：dsDNA ssDNA退火(复性)：模板DNA与引物的互补配对延伸：DNA模板与引物按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新DNA 链新链又可成为下次循环的模板,可将待扩目的基因扩增放大几百万倍,第十一页，共一百一十五页。,5,3,5,3,变性(bin
5、xng),退火(tu hu),延伸(ynshn),第二循环,dsDNA,ssDNA,加入引物,5,3,3,5,dNTP,Taq酶,5,3,5,5,3,3,3,5,5,3,5,5,第十二页，共一百一十五页。,反转录(zhun l)PCR（Reverse transcription PCR，RT-PCR),第十三页，共一百一十五页。,RT,PCR,第十四页，共一百一十五页。,RT-PCR反应(fnyng)过程,反转录(zhun l)PCR：mRNA-cDNA-PCR抽提RNA 反转录合成cDNAPCR 扩增,第十五页，共一百一十五页。,RT反应(fnyng)体系,模板：总RNA，mRNA引物：随机
6、(su j)引物，Oligo(dT)，基因特异性引物（GSP)逆转录酶：AMV M-MLV Quant Reverse Transcriptase,第十六页，共一百一十五页。,PCR反应(fnyng)体系,模板：逆转录产物cDNA目的(md)基因特异性引物；反应混合液：dNTP，Taq聚合酶，Mg+,第十七页，共一百一十五页。,RT-PCR反应(fnyng)产物检测,凝胶电泳分析：初步判断产物的特异性。酶切分析：对扩增产物进行鉴定、对靶基因分型及进行变异性研究。分子杂交：检测产物特异性，分析碱基突变核酸(h sun)序列分析（测序）：是检测PCR产物特异性的最可靠方法,第十八页，共一百一十五页
7、。,实时荧光(ynggung)定量PCR(Fluorescence Quantified real time PCR),与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点(tdin)，目前已得到广泛应用。,第十九页，共一百一十五页。,（1）原理(yunl),实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析(dnglingfnx)的方法。,第二十页，共一百一十五页。,1)常用名词(mng c)概念,扩增曲线(qxin)荧光阈值Ct值,第二十一页，共一百一十五页。,扩增曲线(qxin
8、),第二十二页，共一百一十五页。,设定(sh dn)荧光域值,PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号；荧光域值的设置是3-15个循环的荧光信号的标准差的10倍，即：threshold=10 SDcycle 3-15 意义：大于荧光背景值和阴性对照荧光最高值，进入(jnr)指数期的最初阶段；真正荧光信号：荧光信号大于阈值,第二十三页，共一百一十五页。,荧光(ynggung)阈值（threshold）,第二十四页，共一百一十五页。,Ct值,Ct值的含义是：扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的域值时所需要的循环次数(csh)C代表Cycle（循环数）t代表threshold（荧光域值
9、）,第二十五页，共一百一十五页。,Ct值的确定(qudng),横坐标：PCR循环数纵坐标：荧光信号强 度黑线：荧光域值红线：无模板-域值下一 直线绿线：样品(yngpn)Ct值=17（第17个循环时，荧光信号强度达到域值）,第二十六页，共一百一十五页。,Ct值与起始(q sh)模板的关系,研究(ynji)表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,第二十七页，共一百一十五页。,（2）常用(chn yn)标记方法,非特异性荧光标记：SYBR Green I特异性荧光标记：TaqMan Probe；分子(fnz
10、)信标,第二十八页，共一百一十五页。,SYBR Green I染料(rnlio)法,SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域(qy)的具有绿色激发波长的染料。,第二十九页，共一百一十五页。,SYBR Green I染料(rnlio)法原理,第三十页，共一百一十五页。,注意事项,因为SYBR Green I可以与所有(suyu)dsDNA结合而激发荧光，因此，如果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体，也可以同时被检测，将导致结果不准确；关键：设计特异性引物！,第三十一页，共一百一十五页。,结果判定(pndng)融解曲线,第三十二页，共一百一十五页。,第三十三页，共一百一十
11、五页。,（3）qPCR结果分析相对(xingdu)定量解析,第三十四页，共一百一十五页。,1）相对(xingdu)定量的必要性,第三十五页，共一百一十五页。,必须用内对照(duzho)基因（管家基因）进行校正,第三十六页，共一百一十五页。,2）管家基因筛选(shixun),管家基因：维持细胞生命活动代谢所必须的基因，如GAPDH,beta-Actin,18s rRNA等；筛选方法：根据(gnj)文献提供；通过具体实验。,第三十七页，共一百一十五页。,3）分析方法,双标准(biozhn)曲线法2-Ct法（Ct值比较法）,第三十八页，共一百一十五页。,1）双标准(biozhn)曲线法,通过标准曲线
12、对对照样品、待测样品目的基因及管家基因进行定量(dngling)，然后根据公式计算相对值，即为相对表达量。公式：,校正值(zhn zh),目的基因定量结果,管家基因定量结果,相对值,待测样品校正值,对照样品校正值,=,=,校正值,=,目的基因定量结果,校正值,=,管家基因定量结果,目的基因定量结果,校正值,=,对照样品校正值,待测样品校正值,对照样品校正值,=,待测样品校正值,对照样品校正值,第三十九页，共一百一十五页。,第四十页，共一百一十五页。,优缺点,优点：分析简单，实验优化相对简单；缺点：对每一个(y)基因，每一轮实验均需要做标准曲线；应用：基因表达调控研究,第四十一页，共一百一十五页
13、。,2）2-Ct法,第四十二页，共一百一十五页。,2-Ct法：假设目的基因、对照基因扩增效率均是100%Ct（处理前/对照组）=18-17=1 Ct（处理后/实验组）=16-17.4=-1.4 Ct=Ct（处理后）-Ct（处理前)=-2.4 比率(bl)（处理后/处理前）=2-Ct=2-2.4=5.3结论：JUN处理后表达水平是处理前的5.3倍修正：扩增效率不是1，而是E，2-Ct可修正为（1+E）-Ct,第四十三页，共一百一十五页。,优点(yudin),特异性好；简单、安全、自动化程度(chngd)高；速度快、高通量；线性关系好、线性范围宽,第四十四页，共一百一十五页。,2.生物(shngw
14、)活性检测法,测定细胞因子的生物学活性：刺激细胞增殖、维持细胞生长(shngzhng)和存活、抑制细胞生长(shngzhng)、溶解或杀灭细胞、抗病毒、促进细胞趋化、刺激细胞生成集落等活性；指示细胞：多选用造血系统或淋巴系统细胞，最好用依赖性细胞株细胞；显示细胞反应：用3H-胸腺嘧啶核苷参入，或用四唑盐转化引致的颜色反应。,第四十五页，共一百一十五页。,（1）依赖性细胞株,一些肿瘤细胞株必须依赖于细胞因子方能在体外增殖，如DTLL细胞株依赖IL-2；FDC-PL细胞株依赖于小鼠IL-3；TF-1细胞株依赖于人IL-3和人GM-CSF，因而可利用这些(zhxi)依赖细胞株检测相应的细胞因子；优点
15、：敏感性高，特异性强；缺点：应用有限。,第四十六页，共一百一十五页。,（2）功能(gngnng)检测,利用一些细胞因子的功能特性，可建立(jinl)相应的活性测定方法，如干扰素的抑制病毒感染效应，肿瘤坏死因子对L929细胞的杀伤作用等。优点：敏感性高；缺点：特异性不够，容易受一些扰因素的影响。,第四十七页，共一百一十五页。,A.增殖(zngzh)或增殖(zngzh)抑制法,其基本原理是应用某一细胞因子能特异地刺激或抑制某些(mu xi)指示细胞的增殖，通过3H-TdR掺入或MTT法显色，反映待检细胞因子的活性水平。,第四十八页，共一百一十五页。,B.集落形成(xngchng)法,其基本原理是应
16、用骨髓干细胞体外半固体培养系统，根据不同造血因子能诱导干细胞或定向造血祖细胞形成某一种(y zhn)或某些种类细胞的集落，通过对形成集落形态学、酶学鉴定，计算不同种类集落形成的数量和比例，反映待测标本中CSF的种类和活性水平。,第四十九页，共一百一十五页。,C.直接(zhji)杀伤靶细胞,细胞因子TNF-、TNF-具有直接杀伤某些肿瘤细胞的作用，采用TNF敏感的细胞株如小鼠成纤维细胞株L929，以WEHI164亚克隆13（鼠纤维肉瘤细胞系）作为指示细胞，通过(tnggu)3H-TdR释放法或染料染色等可检测待检样品中TNF的活性水平。,第五十页，共一百一十五页。,D.抗病毒效应(xioyng),靶细胞受某些病毒感染后可发生明显病变和死亡，干扰素可保护靶细胞免受病毒的攻击；常用的病毒是水疱性口炎病毒（vesicular stomatitis virus,VSV），敏感的指示细胞为喉癌的上皮细胞株Hep2和羊膜(yngm)的上皮细胞WISH，通过干扰素（IFN-、IFN-、IFN-）抑制病毒致病变的程度，计算出待测样品中IFN的活性单位。,第五十一页，共一百一十五页。,E.趋化作用(zuy
