1、基因工程 乙肝疫苗的制备,演 讲 者：鞠 林 PPT 制 杨秀兰 李翠华 欧永银,资料提供者：,鞠林,刘珍,王伟杰,彭博,周永斌,李凯,向运新,朱晓东,第一页，共二十二页。,基因工程定义：又称为重组DNA技术，指将某些特定的基因或DNA片断，通过载体或其它手段送入受体细胞，使它们在受体细胞中增殖并表达的一种遗传学操作。是生产出符合人类需要的产品或创造出生物的新性状并能稳定遗传。作用：可把来自任何生物的基因转移到与其毫无关系的任何其他受体细胞中，可以任意改造生物的遗传特性，创造出生物的新性状。某一段DNA可在受体细胞内进行复制，为制备大量纯化的DNA片段提供了可能.,第二页，共二十二页。,获得目
2、的基因,表达载体,重组的表达载体,酶切、连接,宿主细胞,转化、转染等,原核生物细胞,植物细胞,动物细胞,卵细胞,培养的动物细胞,转基因动物,胚胎发育,药物、疫苗,转基因植物,转基因微生物,基因工程药物,人类细胞,基因治疗,第三页，共二十二页。,蛋白质名称 用 途 促肾上腺皮质激素adrenocorticotrophic hormone 治疗风湿rheumatic diseaseB细胞生长因子B-cell growth factor 治疗免疫系统功能失调降钙素(calcitonin)治疗软骨病(osteomalacia)集落刺激因子(colony stimulating factor)治疗血液病
3、、肿瘤辅助治疗绒毛膜促性腺激素(chorionic gonadotropin)治疗不排卵症内啡肽和脑啡肽(endorphine and enkephalin)镇痛剂(analgesic agent)上皮生长因子(epidermal growth factor)促进伤口愈合红细胞生成素(erythropoietin)治疗贫血(anemia)凝血因子(factor)治疗血友病(hemophilia)凝血因子(factor)治疗血友病生长激素(growth hormone)促进生长生长激素释放因子(growth hormone releasing factor)促进生长胰岛素(insulin)治疗糖
4、尿病(diabetes)干扰素(interferon)抗病毒抗肿瘤白细胞介素(interleukin)治疗癌症,第四页，共二十二页。,第五页，共二十二页。,基因重组乙肝疫苗 用基因重组技术把乙型肝炎病毒的外表抗原 HbsAg基因片段插入酵母细胞或哺乳动物细胞的基因中，在体外培养增殖过程中组装或分泌出乙型肝炎外表抗原，然后把外表抗原收集起来提纯之后做成乙型肝炎疫苗。,第六页，共二十二页。,乙肝疫苗的制备,第七页，共二十二页。,目的基因的获取,编码乙型肝炎外表抗原的基因的获取一般的目的基因的获取方法有：反转录法化学合成法 反转录聚合酶链反响法,cDNA文库的建立？,第八页，共二十二页。,cDNA文
5、库的建立,第九页，共二十二页。,工程菌的构建,CHO细胞的特点具有准确的转录后修饰功能,表达的糖基化药物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最 接近于天然蛋白分子具有产物胞外分泌功能,便于下游产物别离纯化;具有重组基因的高效扩增和表达能力;具有贴壁生长特性,且有较高的耐受剪切力和渗透压能力,可以进行悬浮培养,表达 水平较高;CHO 细胞属于成纤维细胞(fibrob2last),很少分泌自身的内源蛋白,利于外源蛋白的后别离,第十页，共二十二页。,材料菌株质粒及细胞大肠杆菌 DH5 和质粒 pMD18-Sm携带改变稀 有密码子后的 S 基因质粒 pCIneoCHO dhfr-细胞pMD18-T
6、 载体,第十一页，共二十二页。,主要试剂限制性内切酶、T4 DNA ligase、质粒 DNA 提取和柱式胶回收试剂盒乙型肝炎外表抗原检测试剂盒DMEM 和透析胎牛血清胰蛋白酶、氨甲喋呤MTX和脂质体 Lipofectamine TMHBsAg 血凝检测试剂盒,第十二页，共二十二页。,目的基因的表达,第十三页，共二十二页。,蛋白质的别离纯化,第十四页，共二十二页。,浓缩与初步纯化离子交换层析疏水层析亲和层析固液别离离心沉淀膜过滤双水相萃取高度纯化DNA的去除热原质的去除病毒的去除,第十五页，共二十二页。,别离纯化的根本要求技术条件温和，保持其生物活性选择性好，到达有效别离纯化的目的技术间可以直
7、接连接，节省工艺步骤收率高，过程快选择别离纯化方法的依据根据产物表达形式来选择根据别离单元之间的衔接来选择根据别离纯化工艺的要求来选择,第十六页，共二十二页。,别离纯化工艺流程,第十七页，共二十二页。,1、发酵液的预处理连续高速离心，除去细胞残片，再超滤浓缩2、疏水柱层析介质：Butyl S Sepharose FF 参加适量硫酸铵，调节电导率与柱层析平衡液电导率相等按照平衡柱床、上样吸附、平衡液洗柱、降低硫酸铵浓度解析、清柱再生程序层析,第十八页，共二十二页。,3、阴离子交换柱层析介质：DEAE Sepharose FFHBsAg活性蛋白经Sephadex G-25柱脱盐换液，使缓冲盐系统的
8、PH、离子强度和IEC平衡液一致按照平衡柱床、丄样吸附、氯化钠浓度梯度分段洗脱、清柱再生程序层析,第十九页，共二十二页。,4、凝胶过滤柱层析介质：Sepharose 4 FF 超滤浓缩到适当体积按照平衡柱床、丄样、洗脱程序层析5、除菌收取到的HBsAg除菌过滤，即为纯品,第二十页，共二十二页。,谢谢欣赏,第二十一页，共二十二页。,内容总结,基因工程。是生产出符合人类需要的产品或创造出生物的新性状并能稳定遗传。某一段DNA可在受体细胞内进行复制，为制备大量纯化的DNA片段提供了可能.。一般的目的基因的获取方法有：。具有产物胞外分泌功能,便于下游产物别离纯化。胰蛋白酶、氨甲喋呤MTX和脂质体 Lipofectamine TM。连续高速离心，除去细胞残片，再超滤浓缩。按照平衡柱床、丄样、洗脱程序层析。谢谢欣赏,第二十二页，共二十二页。,
