1、Journal of Inner Mongolia Medical UniversityApr.2023Vol.45No.2潞党参改善MCAO/R小鼠神经功能损伤的作用及其抗炎机制的网络药理学预测和实验验证（1.山西中医药大学 分子中医药学国家国际联合研究中心，山西太原030024；2.山西中医药大学 中医脑病学山西省重点实验室，山西太原030024；3.山东中医药大学 中医学院，山东济南250355；4.中国医学科学院药物研究所 天然药物活性物质与功能国家重点实验室，北京100050）【摘要】目的 利用网络药理学结合体内实验，探讨潞党参治疗小鼠大脑局部缺血后再灌注损伤的潜在作用机制。方法 对
2、C57BL/6小鼠大脑构建中动脉闭塞再灌注模型（middle cerebral artery occlusion/reperfusion，MCAO/R），建模成功后，将其分为假手术组，MCAO/R模型组，潞党参低、中、高剂量组，进行连续7 d潞党参药物治疗；通过Zea Longa 5级评分法评估MCAO/R小鼠的神经功能损伤情况；利用网络药理学和分子对接技术预测党参治疗缺血性脑卒中（IS）的潜在作用机制和靶点，在此基础上利用Western Blot验证预测靶点。结果 Zea Longa 5级评分法显示，与假手术组相比，模型组小鼠神经功能损伤严重，差异有统计学意义（P0.05）；与模型组相比，潞
3、党参高剂量组小鼠的神经功能有所改善，差异有统计学意义（P0.05）。网络药理学机制研究表明，潞党参抗IS的作用可能与氧化应激、脂代谢以及神经炎症通路相关。分子对接结果显示，潞党参中的苍术内酯和补骨脂内酯可能通过IL-2、MMP12和CXCL12基因靶点改善IS后的神经功能。Western Blot验证结果显示，与模型组相比，潞党参高剂量组分别对MMP12和CXCL12有着不同程度的抑制作用，且差异有统计学意义（P0.05）；党参高剂量组对TNF-的表达有明显的下调作用（P0.57、“Homo sapiens”和P 0.05的标准筛选所得到的靶点。通过 NCBI 数据库中的 Gene 数据库，以
4、“ischemic stroke”为检索词搜索疾病靶点，以“Homo sapiens”作为筛选条件，收集IS的疾病靶点，之后使用Uniprot数据库标准化成分和疾病的靶点基因。1.8.2潞党参和IS的基因交集、蛋白-蛋白相互作用（PPI）的构建 利用Gephi和Venny2.1绘制潞党参和IS的交集基因图。并且对交集基因的分类进行统计。使用 Cytoscape 构建“药物-成分-靶点-疾病”网络图。利用IPA的“Connect”功能构建党参治疗IS的PPI。1.8.3党参治疗 IS 交集基因的疾病、功能和经典通路分析使用 IPA 的 Core Analysis 功能，对交集基因进行分析并制作疾
5、病、功能和经典通路相关图表。1.9党参治疗IS的关键靶点研究通过查阅文献，选择“党参-IS”交集基因中，与CKLF1相关的靶点作为关键靶点。取小鼠MCAO/R一侧的冻存脑组织，在冰上裂解后，测定蛋白浓度，制备样本。配制电泳凝胶，依据所测蛋白浓度确定上样量并依次上样。电泳完成后，将蛋白电转至PVDF膜上，之后进行封闭，接着按照程序敷相应的一抗和二抗。之后用凝胶成像系统显影。图像使用Image J进行分析。1.10统计学方法本研究实验数据使用 Graphpad prism 进行处理，所有数据均用meanSD的形式表示。本研究组间比较用Dunnett法检验，检验水准为=0.05，以P 0.05表示差
6、异具有统计学意义。2结果2.1激光散斑检测脑血流量验证模型建立如图1A，检测和计算小鼠MCAO术后缺血侧与未缺血侧的流量比值，默认MCAO术前缺血侧与未缺血侧的流量比值为100%，以术后该比值降低到60%以下，再灌注后比值恢复至80%以上为造模成功的标准。根据这一标准，对44只小鼠进行MCAO/R造模，其中11只小鼠缺血侧与未缺血侧的流量比值高于60%、9只小鼠术后死亡。最终，24只小鼠符合MCAO/R成功的标准。2.2潞党参减轻IS/R小鼠的神经功能损伤根据Zea Longa 5级评分法对小鼠的神经功能损伤进行了评价，如图1B所示，经过7 d用不同浓度潞党参对MCAO/R小鼠进行治疗，发现潞
7、党参整体改善了MCAO/R小鼠的神经功能，尤其显著改善了高剂量组小鼠的神经功能，差异有统计学意义（P 0.05）。2.3网络药理学预测潞党参治疗IS的机制为了探究潞党参通过何种途径改善MCAO/R小鼠的神经功能损伤，我们使用网络药理学方法预测其作用机制。2.3.1潞党参的活性成分收集、党参治疗靶点和IS疾病靶点的预测 在TCMSP、CRD和Herb中的党参化合物分别有123、10和95个，标准化后，共收集228个化合物。使用SEA数据库预测党参成分作用靶点，得到119个化合物调控的183个靶点基因。在Gene数据库里收集IS相关基因1 247个，筛选后得到612个基因。将党参靶点基因和IS疾病
8、基因进行重叠，显示党参和IS有47个交集基因（见图2A）。2.3.2“药物-成分-靶点-疾病”网络构建与分析为了清晰描述党参治疗IS的潜在机制，我们构建了“药物-成分-靶点-疾病”网络（见图2B）。该网络中有节点168个，边846条。其中，党参节点（黄）、党参成分（绿）、治疗靶点（紫）和疾病节点（红）分别为1个、119个、47个和1个。2.3.3潞党参治疗 IS 的交集基因蛋白互作网络（PPI）构建 为了探究交集基因之间的潜在关系，根据交集基因对应靶点所在位置的不同，构建党参治疗IS交集基因PPI（见图2C）。该网络有节点47个，边640条。其中表达在细胞核内、细胞膜上、细胞质内和细胞外的基因
9、分别为8个、9个、20个和10个。2.3.4潞党参治疗IS的功能、疾病和经典通路分析 为了预测潞党参治疗IS的作用机制，我们使用IPA核心分析功能分析47个交集基因，得到其疾病、功能和经典通路富集结果。核心分析用Fisher精准检验法分析富集结果并得到p-value。对于党参治疗IS所发挥的潜在功能，核心分析富集到了23种图1MCAO术后和再灌注后的脑血流量检测以及潞党参干预MCAO/R小鼠7 d后的神经功能缺损结果AB 136内蒙古医科大学学报2023 年 4 月第 45 卷第 2 期（见图3A），其中脂代谢的-log（p-value）值最高，为35.65，包含43个基因。此外自由基清除也排
10、名靠前，其-log（p-value）值为31.20。这表明潞党参可能通过调节能量代谢（尤其是脂代谢）和抗氧化途径，来缓解IS导致的神经功能损伤。疾病富集了23种（见图3B），炎症疾病的-log（p-value）值最高为31.41，包含41个基因。这表明潞党参可能通过改善炎症状态来治疗IS的神经功能损伤。经典通路富集了160条（见图3C）。前20名的信号通路，炎症相关的有7个，占前20通路的35%（7/20）。神经炎症信号、巨噬细胞相关通路分别排第3和11，-log（p-value）值分别为6.75和5.15。这提示潞党参在IS治疗中的作用与炎症关系极大。2.4潞党参治疗IS的抗炎关键靶点选择结
11、果“2.3”提示潞党参可能抑制炎症反应，又因CLKF1在IS中发挥特异性作用，故以CKLF1为党参抗炎作用的切入点，筛选党参治疗IS的关键靶点。在PubMed上以“CKLF1”为关键词检索文献。得到CKLF1相关的靶点有MPO、TNF、IL1B、p38、JNK14、IL6、STAT315、CCR416、AQP-4、MMP-917、CCR3、IL418、MMP-219等。以上靶点中的MPO和TNF与交集基因重合。此外，CKLF1与炎性因子和MMP蛋白的分泌相关，故选择MPO、TNF、IL2、CXCL12、MMP12、CKLF1和CCR4，构建关键靶点PPI（见图4）。2.5潞党参治疗IS的关键靶
12、点体内实验验证如图5所示，与分子对接预测的结果基本一致，Westem Blot 的结果显示高剂量的潞党参可以降低MMP12在MCAO/R小鼠脑中的表达，差异有统计学意义（P0.05），并且还对CXCL12的表达有显著的下调作用，差异有统计学意义（P 0.05）。另外，潞党参可以显著降低脑卒中后TNF在小鼠脑中的表达，差异有统计学意义（P 0.05）。然而IL2的表达似乎没有受到潞党参的大幅调控，但整体来看，低、中剂量有上调趋势，这与分子对接的结果稍有不同。除此之外，潞党参对MPO的表达有下调趋势，但无统计学意义。潞党参对MCAO/R小鼠脑中CCR4的表达没有影响。图2潞党参和IS的网络药理学结
13、果（A）潞党参和IS的交集基因；（B）潞党参抗IS的“药物-成分-靶点-疾病”网络构建；（C）潞党参-IS交集基因的PPI构建ABC图3潞党参治疗IS的疾病、功能和经典通路分析图4潞党参治疗IS的关键靶点PPI图5MCAO/R小鼠脑中MPO、IL-2、TNF、MMP12、CCR4和CXCL12的表达 137Journal of Inner Mongolia Medical UniversityApr.2023Vol.45No.23讨论中医一般将“IS”称为“中风”“偏枯”和“仆击”等。巢元方在 诸病源候论 中提出“风半身不遂者，脾胃气弱，气血偏虚，为风邪所乘故也”，认为气血虚弱是中风发病的重要
14、因素；张景岳认为中风“皆内伤积损颓败而然”。可以看出，自古以来气血理论贯穿于中风的研究。故在治疗上，古代医家也十分重视补气养血。张景岳提出在治疗中风时需“峻补元气”和“填补真阴，以培其本”；叶天士提出了“攻风劫痰、养血润燥、补气培元”的中风治疗原则。不仅如此，现代医家在此基础上20，从中风的发病机制与机体自身“正虚”的角度出发，提出了IS急性期“扶正护脑”的治疗方法。党参是补虚药的代表。近年来，党参治疗IS的研究逐渐增多7，21，皆表明党参对IS的治疗作用较为明确。本实验表明，潞党参可以改善MCAO/R后小鼠的神经功能损伤，这与目前主流的研究结果一致。在潞党参与IS共同基因功能的富集结果中，自
15、由基清除作用名列前茅。众所周知，氧化应激反应与炎症反应关系密切且相互影响。很多心脑血管疾病中，氧化应激反应和炎症反应往往同时存在，共同促进动脉粥样硬化的产生22。大多数IS的患者，会伴有动脉粥样硬化，且动脉粥样硬化与IS密切相关23。动脉粥样硬化与脂代谢异常的密切关系使我们联想到潞党参可能对IS的发生有积极的预防作用。此外，疾病富集结果显示，有47个共同基因与炎症反应、心血管疾病和神经系统疾病等有关。其中，大多数疾病的发病过程与炎症反应相关。这提示潞党参治疗IS的作用机制可能与抑制炎症反应有关。许多文献也证明了党参可以在缺血再灌注后抑制炎性因子IL-18、TNF-和IL-1的表达24。经典通路
16、富集中排名靠前的通路所调控的靶点主要是炎性因子。与之前功能富集相呼应。另外党参对花生四烯酸信号通路的调控本质上是干预炎症和氧化应激，不过目前党参调控该通路的研究不充分，需要继续挖掘。Westem Blot验证实验的结果表明，分子对接中针对党参关键成分和靶点的预测基本正确。MMP12作为一种促炎因子，近些年来被发现与IS密切相关25，本次实验结果也印证了这一点。临床研究发现26，血清中的CXCL12基因可以作为IS的易感基因。本实验的结果也提示了党参可能部分通过调控CXCL12来减轻IS损伤引发的炎症反应。TNF是一种内源性的促炎因子，在IS/R后会增加表达。治疗之后，TNF的表达会降低，这与本次实验结果一致。IL-2有干预细胞自噬和抗炎的作用27。脑中的神经元、星形胶质细胞以及小胶质细胞都可以分泌IL-2。本次研究发现，潞党参有潜在的提高IS/R脑组织IL-2水平的能力。MPO可以反映IS后中性粒细胞浸润的情况。临床研究显示28，IS/R患者的认知水平与血清中的MPO水平呈负相关。本次研究表明，潞党参干预后，MPO的表达在IS/R的脑中有降低的趋势，虽然没有统计学意义，但是可以推测潞党
