1、 237 食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY提取物与应用2023年 第48卷 第04期收稿日期：2022-06-22 *通信作者 基金项目：河南省自然科学基金项目(182300410079)。作者简介：殷欢(1998)，女，硕士研究生，研究方向为食品营养与健康。殷 欢1，张雅斐2，任顺成1*，李林政3，潘天义3(1.河南工业大学，河南省天然色素制备重点实验室，河南 郑州 450001；2.乐普(北京)医疗器械股份有限公司，北京 102200；3.河南中大恒源生物科技股份有限公司，河南 漯河 462600)摘要：为得到高纯度藻蓝色素，采用盐析、透析、羟基磷灰石(
2、Hydroxyapatite HA)柱层析、SDS-PAGE等方法对螺旋藻中的藻蓝色素进行了分离纯化及分子质量测定，还对藻蓝色素亚基和亚基的结构进行了模拟。经17.5%硫酸铵一步盐析得到藻蓝色素纯度为2.45，50%硫酸铵二步盐析将纯度提高至2.70，再经HA层析得到成品，纯度为4.37；纯化后的样品经SDS-PAGE得到清晰的2条带，分别为亚基和亚基，分子质量为17.2 ku和19.7 ku；用SWISS-MODEL和PyMOL对藻蓝色素亚基的结构进行模拟。实验结果可为藻蓝色素的进一步开发利用提供参考。关键词：螺旋藻；藻蓝色素；盐析；纯化；亚基结构中图分类号：TS 201.2 文献标志码：A
3、 文章编号：1005-9989(2023)04-0237-08Purification and Subunit Structure Analysis of Phycocyanin from Spirulina PlatensisYIN Huan1,ZHANG Yafei2,REN Shuncheng1*,LI Linzheng3,PAN Tianyi3(1.Henan Provincial Key Laboratory of Natural Pigment Preparation,Henan University of Technology,Zhengzhou 450001,China;2.L
4、epu Medical Technology(Beijing)Co.,Ltd.,Beijing 102200,China;3.Henan Zhongda Hengyuan Biotechnology Co.,Ltd.,Luohe 462600,China)Abstract:In order to obtain high-purity phycocyanin,the separation,purification and identification procedures of salting out,dialysis,hydroxyapatite column chromatography a
5、nd SDS-PAGE were established,and the structures of subunits and subunits were simulated.The purity of phycocyanin obtained by one-step salting out with 17.5%ammonium sulfate is 2.45,the purity is increased to 2.70 by two-step salting out with 50%ammonium sulfate,and then the reagent grade finished p
6、roduct is obtained by hydroxyapatite column chromatography with a purity of 4.37;After purification,two clear bands were obtained by SDS-PAGE,which were subunit sum subunits with molecular weights of 17.2 ku and 19.7 ku;The structure of phycocyanin subunit was simulated by SWISS-MODEL and PyMOL.The
7、results can 螺旋藻藻蓝色素分离纯化及亚基结构分析DOI:10.13684/ki.spkj.2023.04.033 238 食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY提取物与应用2023年 第48卷 第04期0 引言螺旋藻(Spirulina)属蓝藻门，是一种古老的低等原核水生植物，其富含蛋白质以及其他活性成分，具有很高的营养价值和生物利用价值，因富含天然色素成分藻蓝色素(C-PC)而在食品领域被广泛关注和研究1。藻蓝色素是一种可捕获光能的水溶性色素，在中性条件下呈靓丽的宝石蓝色，作为GB 27602014食品添加剂使用标准中规定可以使用的2种天然蓝色素之一
8、，常被应用于食品、化妆品、医疗和生物化学研究中。藻蓝蛋白根据纯度(EP)高低被分为3个级别：食品级(EP0.7)、反应级(0.7EP3.9)和试剂级(EP4.0)2。国内外研究者提供了多种从螺旋藻中提取藻蓝色素的方法，但成品纯度不高，仍需进一步纯化。根据藻蓝色素的特性，于光等3通过硫酸铵沉淀和羟基磷灰石(HA)柱分离纯化得到纯度为4.7且具有光敏效应的藻蓝蛋白。于淑坤等4对螺旋藻细胞进行超声处理，再结合盐析、HA和DEAE-Sephadex-A-25分离纯化得到纯度为5.4的藻蓝蛋白。PATIL G等5用DEAE-Sephadex-filled填充阴离子交换层析柱，将藻蓝蛋白的纯化倍数从1.1
9、8提高到3.92，回收率达73%，该方法无需沉淀、离心和透析，极大简化了实验操作，为大规模分离纯化藻蓝蛋白提供了可能性。此外，ERIKSEN N T6也列举了通过多次柱层析得到高纯度藻蓝色素的方法；而王勇等7借助SephadexG-200、DEAE-Sephadex-25、HA、SephadexG-200等一系列纯化程序得到了纯度为14的藻蓝色素，超出国内外现有报告的最高值。结构决定性质，通常认为藻蓝色素的基本结构单位为亚基和亚基，其蓝色来源于结构中呈开链四吡咯结构的藻蓝胆素(PCB)，而PCB则通过硫醚键分别连接在亚基的Cys84和亚基的Cys84、Cys155上8。、亚基之间有极强的同源性
10、，二者先通过各种相互作用等比例结合形成单体()，再根据所处环境聚合形成()3或()69。为进一步探究藻蓝色素的结构和特性，SINGH N K等10模拟了从蓝细菌中分离出的六聚体藻蓝蛋白的晶体结构，为藻蓝蛋白介导的阿尔兹海默症(AD)治疗提供了一种新的基于结构的分子机制。本研究建立了一套低成本高效率的纯化程序，仅通过分步盐析法和羟基磷灰石柱层析法对藻蓝色素进行分离纯化，在简化纯化程序的同时有效提高藻蓝色素的纯度；再根据Gennbank核苷酸序列数据库中的藻蓝蛋白序列模拟亚基和亚基的结构，为其在生产加工过程中更广泛的应用提供参考依据。1 材料与方法1.1 材料与试剂藻蓝色素粗品：纯度为1.79，河
11、南中大恒源生物科技股份有限公司；羟基磷灰石：上海麦克林生化科技有限公司；其他试剂：郑州新丰化验器材有限公司。1.2 实验仪器UV-1600B型紫外可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；TDL-5A型台式低速离心机：江苏省金坛市医疗仪器厂；FA1004型电子分析天平：上海上平仪器公司；PHS-3C型雷磁酸度计：上海仪电科学仪器股份有限公司；MVS-1型旋涡混合器：北京金北德工贸有限公司；KQ-300型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；FY15700型透析袋：江苏南通经纬生物科技有限公司；FW-200型循环水式真空泵：北京中兴伟业仪器有限公司；层析柱：上海联塔仪器有限公司；HL-2型恒流泵：
12、上海青浦沪西仪器厂；EPS-300型电泳仪、Tanon2500凝胶图像分析系统：上海天能科技有限公司。1.3 实验方法1.3.1 藻蓝色素浓度与吸光度的关系曲线 确定藻蓝色素的最大吸收峰：称取少量藻蓝色素，用蒸馏水配制为适当浓度的藻蓝色素溶液，使用紫外分光光度计扫描200700 nm的吸光度值。藻蓝色素标准曲线的制作：准确称取一定量的藻蓝色素，分别加入蒸馏水配制成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mg/mL的溶液，以provide reference for the further development and utilization of phycocyani
13、n.Key words:Spirulina;phycocyanin;salting out;purification;subunit structure 239 食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY提取物与应用2023年 第48卷 第04期蒸馏水为空白对照，立即于620 nm处测量吸光度值，绘制线性回归曲线。1.3.2 原藻蓝色素溶液纯度测定 准确称取藻蓝色素25 mg，定容至50 mL，得到0.5 mg/mL的藻蓝色素溶液，注意避光。使用紫外可见分光光度计测量280 nm和620 nm处的吸光度值，平行测定3次。计算原藻蓝色素的纯度，纯度(EP)计算公式为11
14、：EP=A620/A280式中：EP为藻蓝色素的纯度；A620为溶液在620 nm处的吸光度，是藻蓝蛋白的特征吸收峰值；A280为溶液在280 nm处的吸光度，是藻蓝蛋白的特征吸收峰值。1.3.3 一步盐析 配制一定量0.5 mg/mL藻蓝色素溶液，分别置于10个离心管中，每管15 mL，按梯度依次缓慢加入饱和度为12.5%、15%、17.5%、20%、22.5%、25%、27.5%、30%、35%、40%的硫酸铵，边加边搅拌，溶解完全后4 静置24 h，3500 r/min离心30 min，记录上清液在280、620、652 nm处的吸光度值，平行测定3次，以此计算一步盐析上清液中藻蓝色素的
15、纯度、浓度和得率。同时将沉淀复溶，在200700 nm范围内进行全波长扫描，分析沉淀出的物质。浓度和得率计算公式为12：Cpc=(A6200.474A652)/5.34式中，Cpc为溶液中藻蓝色素的浓度，mg/mL；A620为溶液在620 nm处的吸光度，是藻蓝蛋白的特征吸收峰值；A652为溶液在652 nm处的吸光度，是藻蓝蛋白的特征吸收峰值。得率(%)=(C/C0)100式中：C为当前藻蓝色素溶液的浓度；C0为藻蓝色素溶液的浓度。1.3.4 二步盐析 分析1.3.3实验结果后选择17.5%的硫酸铵饱和度进行二步盐析。设置二步盐析硫酸铵饱和度梯度为30%、40%、50%、60%、70%、80
16、%、90%，溶解完全后4 静置24 h，3500 r/min离心30 min，弃上清液取沉淀，沉淀用0.01 mol/L PBS缓冲液(pH7.0)定容至15 mL，记录280、620、652 nm处的吸光度值，平行测定3次，计算二步盐析后藻蓝色素的纯度、浓度和得率。1.3.5 上柱样品制备 盐析：一步盐析加入硫酸铵至饱和度为17.5%(w/v)，二步盐析追加硫酸铵至饱和度为50%(w/v)，沉淀用少量0.01 mol/L PBS缓冲液(pH7.0)溶解，在4 下保存。透析：将12 ku的干型透析袋(扁宽44 mm)剪下合适长度，于蒸馏水中煮沸10 min，冷却后依次用蒸馏水和透析液(0.01 mol/L PBS pH7.0)冲洗干净(煮沸后所有操作均需戴手套完成)，同时检漏。将盐析后的沉淀溶解液转移至透析袋中，加入量不超过透析袋容量的1/3，4 透析24 h，期间更换透析液45次。充分透析后将透析袋内的截留液于3500 r/min离心10 min去除变性蛋白，获得上柱样品，4 避光保存。1.3.6 羟基磷灰石柱层析 前期准备：配制一定量的0.1 mol/L NaOH溶液，将新开封的羟
