1、522023 年第 3 期（总第 167 期）基于醇脱氢酶催化-动力学荧光分析法测定食品中乙醇的含量覃建军1，卢孜1，吴来燕1，杨安平1，2*（1.中南民族大学资源与环境学院，湖北武汉，430074；2.湖北省生态环境监测中心站，湖北武汉，430070）摘 要：醇脱氢酶（ADH）是生物体内重要的氧化还原催化剂之一，很多醇类代谢都通过醇脱氢酶催化完成。基于以还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和乙醇为底物，在醇脱氢酶作用下催化转化为无荧光的氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）和乙醛，联合动力学荧光分析法测定食品基质中的乙醇含量。通过三因素四水平正交实验，考察得到最佳反应体系为 20L 脱氢酶
2、溶液（31600UL-1），40LNAD 溶液（0.05mol L-1）和 pH 值 8.4 的 Tris-HCl 缓冲溶液（0.05mol L-1）。根据以上体系中还原型 NAD（NADH）荧光值的变化计算酶促反应速度，结合米氏方程测定乙醇含量。金属离子、蛋白质、抗坏血酸等添加剂的干扰实验表明，酶对催化反应具有较高专一性，可以通过 EDTA 等有效避免，该方法在 1.05.0mmol L-1有较好的线性，加标回收实验回收率在 96%104%。该方法具有较高灵敏，较低检测限，能准确测定生物样品和食品样品中乙醇的含量。关键词：NADH；醇脱氢酶；酶法测定；动力学荧光法中图分类号：TS207.3
3、文献标志码：A 文章编号：1008-3103（2023）03-0052-04Determination of Ethanol in Food by Alcohol Dehydrogenase-Fluorescence AnalysisQinJian-jun1，LuZi1，WuLai-yan1，YangAn-ping1，2*（1.CollegeofResourcesandEnvironmentalScience，South-CentralMinzuUniversity，WuhanHubei430074，China.2.HubeiProvincialEcologyandEnvironmentalM
4、onitoringCenterStation，WuhanHubei430070，China）Abstract：Alcoholdehydrogenase（ADH）isoneofthemostimportantredoxcatalystsinlivingorganisms，andmanyalcoholsmetabolismsarecatalyzedbyalcoholdehydrogenase.ThesubstratesofNADHandalcoholweretransformedtobeacetaldehydeandNADHwiththeenzymaticofADH.Therefore，thera
5、teofenzymaticreactionwascalculatedbasedonthechangeinthefluorescencevalueofreducedNAD（NADH）inasystemof20Ldehydrogenasesolution（31600U L-1），40LNADsolution（0.05mol L-1）andTris-HClbuffersolution（0.05mol L-1）atpH8.4，andtheethanolcontentwasdeterminedincombinationwiththeMieequation.Thespiketestandinterfere
6、nceexperimentsshowedexcellentrecoveryrangedfrom96%104%.Thismethodismoresensitiveandhaslowerdetectionlimits，andcandeterminethecontentofethanolinbiologicalsamplesandfoodsamplesKeywords：NADH；alcoholdehydrogenase；enzymaticassay；kineticfluorimetry基金项目：中央高校基本科研业务费专项资金项目平台专项项目“三维多孔少层C3N4-PMS 可见光催化体系降解水体中磺胺
7、类抗生素的机理及其应用研究”（CPT22027）。作者简介：覃建军（1974），男，硕士，工程师，研究方向为环境科学与工程；通讯作者：杨安平（1981），男，高级工程师，硕士，研究方向为水体富营养化。DOI:10.14127/ki.jiangxihuagong.2023.03.004532023 年 6 月基于醇脱氢酶催化-动力学荧光分析法测定食品中乙醇的含量0 引言醇 脱 氢 酶（AlcoholDehydrogenase，ADH，EC1.1.1.1）是一种复合酶，由一个锌分子和两个巯基组成亚基的活性位点，是一种醇与醛、酮可逆反应的氧化还原催化剂1，是生物体内醇类代谢的关键酶2，ADH 是临床
8、诊断肝细胞坏死的特异性指标。常用的乙醇检测方法包括物理法，如气相色谱法、密度瓶法、酒精计法、折射计测定法等，化学法如重铬酸钾比色法、莫尔氏盐法、碘量滴定法、红外光谱法等。此外，酶分析法、生物传感器、色谱法等由于其灵敏度高、快速便捷，是近些年的研究热点2-4。荧光光谱分析法重现性好、灵敏度高、操作简单5，广泛用于生物医学、食品和环境分析等领域6-8。Wang等7发现了通过乙酰胆碱酯酶的荧光生物传感器，可检测有机磷农药。王春晓等9基于酶标仪比色法检测浊米酒中 6 种高级醇（异丁醇、异戊醇、苯乙醇、正丙醇、正丁醇、己醇）含量。Fu 等10以来自骆驼的四溴双酚A 特异性纳米抗体与碱性磷酸酶融合的双功能
9、融合蛋白，创建了一种快速和高灵敏度的荧光酶联免疫吸附试验来监测土壤样品中的四溴双酚 A。Xiong 等11采用竞争性荧光免疫测定法，以模板铜纳米粒子为荧光指示剂，对黄曲霉毒素 B1 进行超灵敏检测。李冰柯等12基于酶催化荧光光谱法测定尿液中多巴胺的含量。生物辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）中的主要发光结构是烟酰胺基团，其荧光发射峰位于 460nm 附近。由于 NADH 具有自发荧光的特性，这使得其内源性荧光成为一种优良的细胞代谢状态的生物荧光标记物，而 NAD+是不发光的，因此 NADH/NAD+这一对氧化还原物质被广泛用于各种脱氢酶研究，并且在很多代谢现象的解释及疾病监测等领域取得了诸多
10、应用13，14。本文采用动力学荧光光谱分析法测定乙醇含量，在合适的 pH 下，以自发强荧光的还原型 NADH 和乙醇为底物，在醇脱氢酶的催化下，转化为乙醛和无荧光的氧化型 NAD+，以低底物浓度下的脱氢酶反应速度，即“初始速度”（即 10%的底物被转化）和反应时间，基于米氏方程计算双倒数作标准曲线。该测定法能满足不需要底物完全转变的条件，因此可减少酶促反应时间和酶的用量。基于生物酶促反应的专一性，本研究能较好地避免试样中共存组分的干扰，减少预处理过程。该荧光分析法比紫外吸收法更灵敏、检测限更低15,16，能测定生物样品和食品等基质较复杂的样品中乙醇的含量。1 材料与方法1.1 仪器与试剂LS5
11、5 型荧光光度计（PerkinElmer 公司）。0.17mol L-1EtOH 标准溶液、0.05mol L-1NAD、0.2mol L-1乙二胺四乙酸二钠（EDTA）、10g L-1ADH（Sigma 公司），0.05mol L-1Tris-HCl 缓冲液（pH 值为 8.4）。1.2 实验方法将 50LEtOH 标 准 液、40LNAD 溶 液、10LADH 溶液依次加入装有 Tris-HCl 缓冲液的石英比色皿中，快速混匀，根据荧光强度变化值，计算酶促反应速度。v=FV/（tkb）（1）式中：v、k、F分别为酶促反应速度（mol min-1）、荧光系数（L mmol-1 cm-1）和荧
12、光强度变化值；V、t、b分别代表反应体积（mL）、时间变化值（min）和比色皿宽度（cm）。乙醇浓度计算为：1/v=Km/（VmaxC）+1/Vmax （2）式 中：Vmax、C、Km依 次 为 最 大 酶 促 反 应 速 度（mol min-1）、乙 醇 浓 度（molL-1）和 米 氏 常 量（molL-1）。1.3酶促反应条件优化在 25下，以 F为指标，以脱氢酶用量、NAD溶液用量、Tris-HCl 缓冲液 pH 值为考察因素，进行 3因素 4（34）水平正交实验，优化酶促反应条件。正交水平因素见表 1。表 1正交因素水平表水平因素A 脱氢酶用量/LBNAD 用量/LTris-HCl
13、缓冲液pH 值110408.0220608.4330808.84501009.22 结果与分析2.1 还原型 NAD（NADH）的荧光光谱本方法基于 NADH 荧光强度的变化建立动力学方程计算乙醇含量，因此首先进行 NADH 荧光光谱试验，NADH 的最大荧光激发波长（ex）和荧光发射波长（em）分别为 340nm 和 455nm，见图 1A。542023 年第 3 期（总第 167 期）图 1（A）NADH 的荧光光谱 pH=8.4（Tris-HCl）；（B）测定乙醇的标准曲线2.2 乙醇测定的标准曲线根据实验方法测定不同浓度的乙醇标准溶液的荧光强度变化（图 1B），计算其酶促反应速度，由于
14、反应速度只是在底物浓度很低时才与之成正比，当底物浓度增高时，vc 线逐渐弯曲，而根据米氏方程，1/v1/c为直线关系，因此用双倒数作图法，以 1/v为纵坐标，1/c为横坐标，绘制了计算乙醇含量的标准曲线，线性范围为 1.05.0mmol L-1。得到线性回归方程为 1/v9.0910-7（1/c）+0.00246，r2为 0.9976，方程检出限为 4.010-6mol L-1。2.3 正交实验结果分析由表 2 可知，用极差分析法对测定结果进行了分析，3 个考察因素中脱氢酶用量的极差 R（148.3）最大，对 F的影响最大，依次为 Tris-HCl 缓冲液 pH值和 NAD 用量。因此，为使形
15、成 F的动力学曲线有较宽的线性范围和实验实用性，首先根据 R 值最大原则，确定了 A 为关键因素。在 A2 和 A4 水平下，F跨度较大，分别在以上两个水平下确定实验反应条件为 A4B1C4 和 A2B1C2，同时为进一步降低实验成本，选择了 A2B1C2，即脱氢酶溶液用量、NAD 溶液用量分别为 20L 和 40L，Tris-HCl 缓冲溶液的 pH 值为 8.4。表 2 正交实验结果表序号A 脱氢酶用量（L）BNAD 用量（L）CTris-HCl 缓冲液 pH 值F1111123.42122123.53133123.84144135.75212208.06221180.87233157.6
16、8244190.49313234.010324268.811331227.112342250.013414306.014423276.415432282.416441234.0K1126.6218.2191.4K2184.2212.4216.0K3245.1197.7206.3K4274.9202.6217.2R148.320.525.82.4 共存组分对乙醇测定的影响为验证本文方法的选择性，分别测定了底物 NAD与多种醇（甲醇、苯甲醇、正丁醇、正己醇、乙二醇、异丙醇、丙三醇和异丁醇）的反应。结果发现，与乙醇溶液相比，醇脱氢酶也能催化正丁醇和正己醇与ADH 反应，且反应速度较快。此外，为验证方法的抗干扰性，实验测定了食品常见的共存组分，如金属粒子，对酶促反应速度的影响。结果发现，金属离子抑制了酶促反应，其抑制作用与金属抑制剂浓度成正比，与反应速度成反比，此抑制作用可通过加入金属络合剂 EDTA 部分消除。乙醇干扰实验表明，当 EDTA 为5mmol L-1，相对误差为 5%时，多种金属干扰组分的允许量（mol L-1）分别为 Pb2+（1280）、Cu2+（321）、Co2+（16.0
