1、研究报告Research Report百合 LdGASA1 基因克隆与生物信息学及表达分析李雪艳1胡新颖1白一光1王伟东1周俐宏1赵统利2杨迎东1*刘威生3*1辽宁省农业科学院花卉研究所,沈阳,110161;2连云港市农业科学院花卉研究中心,连云港,222006;3辽宁省农业科学院果树研究所,营口,115009*共同通信作者,;摘要本研究从百合小鳞茎发育不同阶段蛋白质组数据中，筛选出调控鳞茎发育的上调表达基因LdGASA1，对其进行克隆、生物信息学分析及表达分析。序列分析显示 LdGASA1 基因全长 725 bp，编码区CDS 序列为 336 bp，编码 111 个氨基酸。结构域分析显示，L
2、dGASA1 第 52 至第 111 个氨基酸含有一个典型的 GASA 保守结构域。其理化性质分析显示，编码蛋白质理论等电点(pI)为 9.1，不稳定系数为 35.14，属于稳定的疏水性蛋白，亚细胞定位预测该蛋白最可能定位在细胞质中，其二级结构主要为无规则卷曲(65.86%)和-螺旋(22.52%)，另外含有少量延伸链(12.60)和-折叠(9.01%)。通过 RT-qPCR 分析发现 LdGASA1 基因在小鳞茎出现前表达量相对较低，主要在小鳞茎形态建成和发育阶段表达，且在小鳞茎形态基本建成(35 d)时表达量达到最高。本研究结果为探索 GASA 基因调控百合生长发育的机制打下基础。关键词百
3、合;鳞茎发育;GASA 基因;生物信息学分析;表达分析Cloning,Bioinformatics and Expression Analysis of Lilium LdGASA1 GeneLi Xueyan1Hu Xinying1Bai Yiguang1Wang Weidong1Zhou Lihong1Zhao Tongli2Yang Yingdong1*Liu Weisheng3*1 Institute of Flowers,Liaoning Academy of Agricultural Science,Shenyang,110161;2 Flower Research Center,
4、Lianyungang Academy of Agricultu-ral Sciences,Lianyungang,222006;3 Institute of Pomology,Liaoning Academy of Agricultural Science,Yingkou,115009*Co-corresponding authors,;DOI:10.13271/j.mpb.021.004579AbstractIn this study,the upregulated LdGASA1 gene regulating bulb development was screened from the
5、 pro-teomic data at different stages of lily bulb development,and its cloning,bioinformatics analysis and expressionanalysis were carried out.Sequence analysis showed that the full length of LdGASA1 gene is 725 bp,and the CDSsequence is 336 bp,encoding 111 amino acids.Domain analysis showed that the
6、 52111 amino acids of LdGASA1contained a typical GASA conserved domain.It is a stable hydrophobic protein with a theoretical isoelectric point(pI)of 9.1 and an instability coefficient of 35.14.It is located in the cytoplasm,and its secondary structure is domi-natedbyirregularcoils(65.86%)and-helix(2
7、2.52%),withasmallamountofextendedchains(12.60)and-folded(9.01%).RT-qPCR analysis showed that LdGASA1 gene was not expressed before the appearance of bulblets,butwas mainly expressed at the morphogenesis and development stages of bulblets,and the expression level reachedthe highest at the basic morph
8、ogenesis of bulblets(35 d).The results of this study laid a foundation for exploringthe mechanism of GASA gene regulating the growth and development of lily.KeywordsLilium;Bulb development;GASA gene;Bioinformatics analysis;Expression analysis基金项目：本研究由辽宁省重点研发项目(2020JH2/10200016)、辽宁省自然科学基金项目(2019-ZD-0
9、379)、辽宁省科技特派项目(2020020015-JH5/101)、辽宁省农业科学院院长基金项目(2020QN2404)和沈阳市博士后资助资金共同资助引用格式：Li X.Y.,Hu X.Y.,Bai Y.G.,Wang W.D.,Zhou L.H.,Zhao T.L.,YangY.D.,and Liu W.S.,2023,Cloning,bioinformaticsand expression analysis of Lilium LdGASA1 gene,Fenzi Zhiwu Yuzhong(Molecular Plant Breeding),21(14):4579-4586.(李雪艳,
10、胡新颖,白一光,王伟东,周俐宏,赵统利,杨迎东,刘威生,2023,百合 LdGASA1 基因克隆与生物信息学及表达分析,分子植物育种,21(14):4579-4586.)分子植物育种，2023 年，第 21 卷，第 14 期，第 4579-4586页Molecular Plant Breeding,2023,Vol.21,No.14,4579-4586分子植物育种Molecular Plant Breeding图 1 LdGASA1 的 CDS 区域电泳注:M:DL2000 DNA Marker;1:LdGASA1 CDS 片段Figure 1 The electrophoresis of L
11、dGASA1 CDS regionNote:M:DL2000 DNA Marker;1:LdGASA1 CDS region百合观赏价值高，可用于切花、盆栽、庭院栽植，同时具有食用和药用价值，经济体量巨大，在中国农业经济发展和乡村振兴中发挥重要作用。种球品质是影响百合生产的关键因素，中国从 20 世纪 90 年代开始百合种球国产化研究，至今没有实现高品质种球规模化生产，关键问题在于：中国百合种球发育基础理论研究落后，新生小鳞茎的形成机制尚无系统研究，种球生长发育机制不明确，无法指导种球生产。因此，深入研究小鳞茎形成与种球生长发育机制，为百合种球繁育提供理论指导，对解决产业发展中存在的“卡脖子”
12、问题，增强中国百合产业发展的自主性具有重要意义。研究表明百合鳞茎的形成和发育受多种植物激素的调控，如 IAA、赤霉素(Gibberellin,GAs)、ZR 等(金淑梅等,2005;孙晓杰,2008)。GAs 在植物开花、果荚发育、种子萌发、茎的伸长、根的形成等过程中有重要的调控作用(Fleet and Sun,2005)，此外研究发现GA3处理有利于获得个体较大、形状匀称的健壮鳞茎，可显著促进小鳞茎膨大及增重(孙红梅等,2009)。GASA/Snakin(Gibberellic acid sitmulated Arabidopsis)类基因是一个低分子量的多肽和赤霉素调控家族，在植物生长发育
13、和对非生物和生物胁迫的反应中起着至关重要的作用，包括参与种子萌发(RubinovichandWeiss,2010)、侧根的发育(Zimmermannetal.,2010)、茎和枝条伸长(Hou et al.,2018;Nahirak et al.,2019)、开花(Zhangetal.,2009)、花和果实发育(Moyano-Caete etal.,2013)、生物(Mao et al.,2011)与非生物胁迫(Sun etal.,2013)以及激素信号转导(Rubinovich et al.,2014)等多个过程。这是因为 GASA 蛋白即可作为植物信号途径的下游靶基因参与调控植物的生长发育
14、，又可在植物的生长和发育过程中作为调控蛋白胞间信号肽发挥作用。基于课题组前期所得百合鳞茎发育蛋白质组数据，发现 LdGASA1 基因在百合鳞茎发育不同阶段差异表达，本研究通过 RACE 技术克隆 LdGASA1 基因全长序列并对其进行生物信息学分析，利用实时荧光定量 PCR(RT-qPCR)检测其在百合鳞茎发育不同阶段的表达情况，为探索 GASA 基因调控百合生长发育的机制打下基础。1结果与分析1.1 LdGASA1基因的克隆提取百合鳞茎 RNA 并反转录为 cDNA，根据蛋白质组测序得到的 LdGASA1 基因片段设计引物，进行RT-PCR 扩增及 RACE 克隆。结果显示，3RACE 克隆
15、片段长度为 64 bp，5RACE 克隆片段长度为 434 bp，LdGASA1 基因中间片段长度 659 bp，最后拼接获得LdGASA1 全长为 725 bp，CDS 序列为336 bp，编码111 个氨基酸(图 1)。1.2蛋白理化性质分析利用 NCBI 保守结构域分析网站分析，结果显示LdGASA1 蛋白的 52111 个氨基酸区间为 GASA超家族保守结构域，证实 LdGASA1 蛋白属于 GASA家族蛋白(图 2A)。通过 ProtParam 工具分析 LdGA-SA1 蛋白的氨基酸序列，发现 LdGASA1 蛋白共编码111 个氨基酸，其相对分子质量为 11.79 kD，理论等电
16、点 9.1，分子式 C506H819H147O145S16，原子总数 1 633，不稳定系数 35.14，属于稳定蛋白，脂肪系数 71.26。利用 Protscale 预测 LdGASA1 基因编码蛋白的亲疏水性，结果显示，第 16、17 两个氨基酸位点处的疏水性最好，而第 106 个氨基酸位点处亲水性最强，亲水值为-2.067，亲水性平均值为 0.243，表示该蛋白质为疏水蛋白(图 2B)。通过 TMHMMSeverv.2.0 分析发现该蛋白质的 16 位氨基酸位于细胞膜内部，726 位氨基酸之间形成一个典型的跨膜螺旋区，27111 位氨基酸位于细胞膜表面，这表示 LdGASA1 蛋白极有可能是一个跨膜蛋白(图 2C)。采用 SignalP 在线软件分析 S 值(每个氨基酸对应 1 个 S 值,信号肽区域的S 值较高)、C 值(剪切位点的值,每个氨基酸会有一个C 值,剪切位点处 C 值最高)、Y 值(综合考虑 S 值和C 值)来预测 LdGASA1 蛋白信号肽，发现该蛋白含有一个信号肽剪切位点，位于第 24 个和第 26 个氨基酸之间，因此推测 LdGASA1 是分泌蛋白(图 2 D
