1、从江香猪CYP2D25 mRNA表达特性研究杨家大1（凯里学院，贵州 凯里556011）摘要：为分析从江香猪CYP2D25 mRNA的组织分布和诱导特性，累积其药物代谢模型研发基础资料，应用实时荧光定量PCR方法研究从江香猪CYP2D25 mRNA的组织分布，以及利福平对其表达的影响.研究结果发现：CYP2D25 mRNA在从江香猪肝脏、十二指肠、皮肤、肾脏、胃、心脏、肺、大脑和脊髓均有表达，以肝脏中表达水平最高，为8.819 0，显著高于其余组织；肾次之，再次为皮肤、大脑、脊髓及十二指肠；心最低.利福平处理组从江香猪只有肝脏检测到CYP2D25 mRNA表达，其表达水平与对照组无显著差异.研
2、究结果与人体同源酶CYP2D6 mRNA的表达特性类似，提示从转录层面看从江香猪可用于人CYP2D6所代谢药物的安全性评价研究.关键词：CYP2D25；表达特性；从江香猪中图分类号：Q95文献标识码：A文章编号：1673-9329（2023）03-0056-08细胞色素P450（cytochrome P450，CYP450），又称混合功能氧化酶和单加氧酶，是广泛存在于生物体内的一组结构和功能相关的超家族基因编码的含铁血红素同工酶，因还原型细胞色素P450 与一氧化碳复合物在 450 nm 处有一吸收峰，故命名为 CYP4501.目前，已确定了人类CYP450 包含 18 个家族 44 个亚家族
3、2-3.其中，涉及药物代谢的 CYP450 主要包括 CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4等7种重要亚型4，主要存在于细胞的内质网和线粒体内膜上，负责代谢70%80%的临床药物和其他外源性化合物5.在肝脏催化第相反应中，许多外源性化合物（包括药物、化学致癌物和毒素）通过氧化还原、水解反应转化为水溶性强的化合物，再经第相反应，形成高度可溶的复合物以便排出体外6.人类CYP2D6是CYP超家族酶系的重要成员之一，其含量在肝脏P450含量中所占比例虽然只有约4%，但它参与代谢的药物量却占P450药物代谢总量的25%30%.其包括抗心律失常
4、药、抗肿瘤药、抗抑郁药、抗精神病药等7-9，在80多种重要药物的氧化代谢中起作用，例如阿米替林、氯丙咪嗪、氟哌啶醇、苯乙双胍、可待因、丙咪嗪和异喹胍等10，猪体内的同源酶为CYP2D2511.收稿日期：2023-03-28基金项目：贵州省科技厅、黔东南州科技局、凯里学院科技合作协议项目（黔科合LH字 2017 7175号）；国家自然科学基金（81460572）作者简介：杨家大（1975-），男，贵州天柱人，凯里学院大健康学院教授，博士，研究方向为地方特色畜禽品种资源的发掘、研究及开发利用.第 41 卷第 3 期2023 年 6 月凯里学院学报Journal of Kaili Universit
5、yVol.41 No.3Jun.202356从江香猪基因纯合，近交不退化，解剖学、生理学、生化学指标与人相似，体型矮小，性情温顺，易于实验操作，抗病力强，繁殖速度快，生产成本低，是替代猴和犬用作药物评价实验的理想动物来源12，作为新药安全性评价实验动物具有良好前景.但是有关其CYP酶的研究资料还较少，而CYP450酶的亚型酶存在明显的种属差异，同一药物在不同种属体内的代谢途径和代谢产物可能不同，以动物模型研究结果外推到人时需要考虑动物与人CYP450酶的种属差异13-14.而且CYP酶存在组织特异性，各组织器官主要CYP酶的种类及含量各不相同15.因此，新药研发过程中预以从江香猪预测候选化合物
6、在人体内的代谢情况、产生的毒性等，其前提就是要对从江香猪CYP特性有全面深入的理解.鉴于此，本研究拟通过应用TaqMan实时荧光定量PCR方法对从江香猪肝脏、十二指肠、皮肤、肾脏、胃、心脏、肺、大脑和脊髓CYP2D25 mRNA进行定量分析，探索其组织分布特征，并以利福平处理从江香猪，研究利福平对从江香猪CYP2D25 mRNA表达的影响，为从江香猪的药物代谢模型应用提供基础资料.1实验材料、试剂与仪器1.1实验材料实验样品为购自贵州省从江县传福养殖场的8头45月龄从江香猪，体重为26.531.5 kg，随机分为对照组（4头）和利福平处理组（4头）.处理组按照40 mg/kgd腹腔注射利福平，
7、每天1次，连续给药4天，自由饮水.从江香猪屠宰后，立刻取出肝脏中叶、大脑、胸椎脊髓、臀部皮肤、左肺、心、肾皮质、十二指肠、胃大弯等组织部位，经生理盐水清洗后，液氮中冻存备用.1.2实验试剂实验试剂中总 RNA 提取试剂 RnaExTMTotal RNA Isolation Solution、逆转录试剂盒 RayScriptcDNA Synthesis Kit、即用型 UltraTaq 酶 PCR 试剂盒、琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒和 pTG19-TPCR产物克隆试剂盒均为上海捷瑞生物工程有限公司产品，实时荧光定量 PCR试剂盒 Real-time PCR Master Mix为Toyobo
8、公司产品1.3实验仪器实验仪器主要有全自动样品快速研磨仪（上海净信科技有限公司），Powerpac Basic电泳仪（Bio-Rad公司），Mini Centrifuge八联管离心机（Eppendorf公司），ABI7900实时荧光定量PCR仪（美国Applied Biosystems公司）2实验方法2.1引物及TaqMan探针的设计与合成根据猪CYP2D25、-肌动蛋白（-actin，ACTB）、TATA盒结合蛋白（TATA-box bindingprotein，TBP）基因mRNA序列设计引物和探针，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，见表1.其中，引物为标准品PCR和荧光定量PCR共用.探针
9、的5 端和3 端分别标记荧光报告基团6-FAM和荧光淬灭基团BHQ1.57表1扩增引物及探针信息基因CYP2D25ACTBTBP登录号NM_14394.1XM_003124280.4XM_013991786.1序列名称前引物TaqMan探针反引物前引物TaqMan探针反引物前引物TaqMan探针反引物序列ATGAGAACCTCCGCCTGGTGGCTCACCTGTTCTCCGCTGGACGTCTGGGTGCAGGATCGGCGCTTGACTCAGGATTTATGCTCCATCCAACCGACTGCTGTCTCGGCCACATTGTAAAACTTTACAGAGAACTCCAGAGCGTCCTGT
10、AAGTTGCTCGTACTGTGCTGCACCAACTTGTCAACAGCAGTA退火温度/理论57.267.655.456.766.957.050.964.152.1标准品反应555555定量反应606060扩增子长度/bp105921142.2总RNA提取5 mg 冻存组织加入 0.3 mL RnaExTMTotal RNA Isolation Solution，研磨 20 s，再加入 0.7 mLRnaExTMTotal RNA Isolation Solution，颠倒混匀，室温裂解 5 min.然后氯仿抽提，吸附柱分离，DEPC水洗脱，即得总RNA.最后经琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性
11、.2.3cDNA合成逆转录反应组成：250 M Random Primer 0.4 L，60 M Oligo（dT）0.4 L，5 RT ReactionBuffer 2.0 L，25 mM dNTP 0.4 L，25 U/L RNase Inhibitor 0.4 L，200 U/L M-MLV ReverseTranscriptase（RNase H-）0.4 L，总RNA 800-1000ng，DEPC水补足至15L.37反应60 min，然后85终止5 min.2.4标准品制备标准品扩增反应组成：2 Taq Master mix 25 L，10 mol/L的上、下游引物各1.0 L，c
12、DNA2.0L，去离子水补足至50 L.95预变性4 min，然后进行40个循环.每个循环包括94变性30 s，55 退火30 s，72延伸40 s.最后一个循环结束后再72延伸5 min.扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后回收纯化.连接反应体积为10 L，其中25 ng/L pTG19-T vector 2.0 L，回收产物2.0 L，2 quick ligation solution 5 L，ddH2O 1.0 L；反应程序为22 2 h.连接产物转化至感受态细胞，挑取阳性克隆培养、鉴定、10倍梯度稀释，得到实时荧光定量标准品.582.5实时荧光定量PCR反应体积为 10 L，其中预混的 Mix
13、和引物混合物（含 Mix 10.0 L，5.0 pmol/L 的前引物0.5L，5.0 pmol/L的反引物0.5 L，2.5 pmol/L TaqMan探针0.25 L）5.0 L，cDNA 5.0 L.反应程序为95预变性5 min；95变性10 s，60退火及延伸34 s，40个循环.反应设置标准品对照和空白对照.2.6统计分析CYP2D25基因的表达水平以其mRNA拷贝数与内参基因mRNA拷贝数之比表示，差异显著性检验均采用IBM SPSS Statistics 19中非参数检验进行.3实验结果与分析3.1标准曲线及扩增曲线以10倍梯度稀释标准品为模板进行实时荧光定量PCR，得到标准曲
14、线（图1）.可见，R20.99说明数据变化与曲线之间的拟合度高.图1实时荧光定量标准曲线以组织样品cDNA为模板进行实时荧光定量PCR，得到扩增曲线（图2）.图2实时荧光定量扩增曲线3.2基因的表达水平应用ACTB、TBP基因作内参，以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR，得到对照组及利福平59处理组从江香猪组织CYP2D25 mRNA表达水平，见表3.表3从江香猪主要组织及利福平处理组从江香猪肝脏CYP2D25 mRNA的表达水平内参基因ACTBTBP组别对照组REF组对照组REF组猪号1#2#3#4#中位数9#10#11#12#中位数1#2#3#4#中位数9#10#11#12#中位数肝脏1
15、6.084 69.254 73.711 28.383 48.819 0 a5.231 86.351 13.292 87.132 15.791 46 312.672 15 285.232 81 376.548 04 193.267 94739.2504a1 548.236 51 435.783 2855.609 82 577.968 42 063.102 4十二指肠0.003 00.003 20.003 00.003 20.003 1 d3.008 53.000 02.606 712.843 43.004 3 e皮肤0.005 40.009 30.007 10.015 30.008 2 c3.1
16、32 9-5.712 512.234 65.712 5 e肾脏2.016 20.711 61.499 71.2941.396 9 b985.229 3517.764 7768.600 0404.896 2643.182 4 b胃0.002 20.000 50.002 70.002 10.002 2 e2.420 60.286 02.137 91.645 61.891 8 cd心脏0.001 30.0020.001 30.002 10.001 6e0.426 20.458 50.188 60.676 10.442 4 c肺脏0.001 30.000 50.001 10.000 80.000 9 e1.693 90.545 51.321 00.766 71.043 9 cd大脑0.010 20.003 30.023 60.018 30.014 3 c3.645 31.240 912.410 36.078 64.862 0 de脊髓0.007 20.024 30.010 40.017 70.014 1 c3.194 67.223 55.070 712.766 76.147 1 e注：不同列中
