1、第 41 卷第 2 期2023 年 4 月广东医科大学学报JOURNAL OF GUANGDONG MEDICAL UNIVERSITYVol.41 No.2Apr.2023212耐碳青霉烯酶铜绿假单胞菌的耐药性分析及碳青霉烯酶初筛试验的应用闫津津，杨会林，车华涛，陈娟，陈霖（北京大学深圳医院检验科，广东深圳，518000）摘要：目的了解耐碳青霉烯酶铜绿假单胞菌（CRPA）的临床分布、对抗菌药物的耐药性及携带的碳青霉烯酶基因型。方法回顾性分析北京大学深圳医院住院患者临床样本分离的 61 株CRPA 的科室分布、标本来源及耐药情况。随机挑取 36 株CRPA，采用乙二胺四乙酸（EDTA）双纸片增
2、效法和免疫层析法进行碳青霉烯酶初筛试验。结果61 株CRPA 主要分布ICU 24 株（39.34%）、呼吸内科 9 株（14.75%），脑外科 7 株（11.48%）。其标本来源以痰液为主，共 49 株（80.33%）。药敏试验结果显示，亚胺培南和美罗培南的耐药率分别达 100.00%和 78.69%，而氨基糖苷类药物阿米卡星耐药率最低，为 8.20%。61 株CRPA 碳青霉烯酶初筛试验检测出金属-内酰胺酶型阳性菌株 3 株（1 株既产丝氨酸酶又产金属酶），丝氨酸酶型阴性菌株 29 株；CRPA 耐药基因测序结果显示，有 3 株CRPA 携带金属-内酰胺酶blaIMP-45 基因，32 株
3、CRPA 携带丝氨酸酶OXA-50 基因，未检出KPC、GES 丝氨酸酶型及NDM、VIM 金属酶型基因。结论CRPA主要分布于ICU，以痰液标本为主，其菌株多携带丝氨酸酶OXA-50 基因；应针对不同科室加强医院防控措施，临床则应根据药敏试验选择抗菌药物预防CRPA 传播。关键词：耐碳青霉烯酶铜绿假单胞菌；金属-内酰胺酶；丝氨酸酶；细菌耐药性；临床分布中图分类号：R 917 文献标志码：A 文章编号：2096-3610（2023）02-0212-04Analysis on drug resistance of carbapenemase-resistant Pseudomonas aerug
4、inosa and clinical application of primary screening test for carbapenemaseYAN Jin-jin,YANG Hui-lin,CHE Hua-tao,CHEN Juan,CHEN Lin(Laboratory Department,Peking University Shenzhen Hospital,Shenzhen 518000,China)Abstract:ObjectiveTo analyze the clinical distribution,drug resistance and carbapenemase g
5、enotypes of carbapenemase-resistant Pseudomonas aeruginosa(CRPA).MethodsThe department distribution,specimen source,and drug resistance of 61 strains of CRPA isolated from clinical samples of inpatients at Peking University Shenzhen Hospital were retrospectively analyzed.Thirty-six CRPA strains were
6、 randomly selected for carbapenemase detection with EDTA double disk synergy method and immunochromatography.ResultsOf the 61 CRPA strains,there were 24 strains(39.34%)distributed in the ICU,9 strains(14.75%)in the respiratory department,and 7 strains(11.48%)in the department of brain surgery.Sputum
7、 was the main source of the specimens,covering a total of 49 strains(80.33%).The drug susceptibility test results showed that the resistance rates of imipenem and meropenem were 100.00%and 78.69%,respectively,and that of the aminoglycoside drug amikacin was the lowest(8.20%).The carbapenemase screen
8、ing test for the 61 CRPA strains identified 3 metallo-lactamase-positive strains(1 of which produced both serinase and metalloenzyme),and 29 serinase-negative strains;CRPA drug resistance gene sequencing results showed that 3 CRPA strains carried metallo-lactamase blaIMP-45 gene and 32 CRPA strains
9、carried serine OXA-50 gene,KPC,and no GES serine enzyme type,NDM,VIM metalloenzyme type genes were identified.ConclusionCRPA is mainly distributed in ICU,and in sputum specimens,and its strains mostly carry-lactamase OXA-50 drug resistance genes.Hospital prevention and control measures should be str
10、engthened for different departments,and antimicrobial drugs should be selected according to drug susceptibility test for clinical treatment to prevent the spread of CRPA.Key words:carbapenemase-resistant pseudomonas aeruginosa;metallo-lactamase;serinase;bacterial resistance;clinical distribution收稿日期
11、：2022-11-14作者简介：闫津津（1980-），女，硕士研究生，副主任技师，E-mail：第2期闫津津，等.耐碳青霉烯酶铜绿假单胞菌的耐药性分析及碳青霉烯酶初筛试验的应用213铜绿假单胞菌（PA）又称绿脓杆菌，为革兰性阴性菌，广泛分布于自然界，适宜在潮湿环境、空调、医院、水池等环境繁殖，易发生医院感染流行1。在人体免疫力低下或菌群失调时更易感染PA2。近年来，抗菌药物耐药问题愈发严重，PA 的临床耐药菌株检出率直线上升，甚至出现多药耐药PA。而碳青霉烯类抗菌药物作为临床治疗多重耐药菌感染也不例外，其耐药性药物包括亚胺培南和美罗培南等3-5。PA 的耐药机制主要包括碳青霉烯酶的产生、外膜孔
12、蛋白的丢失等6。耐碳青霉烯酶铜绿假单胞菌（CRPA）的日益增多使临床感染防控工作更加棘手7。研究CRPA 的耐药机制对防控耐药菌株的传播具有重要意义。本研究分析了CRPA 的临床分布、对抗菌药物的耐药性、携带的碳青霉烯酶基因型，以期为临床用药提供参考依据。1材料和方法1.1标本来源收集 2020 年 1 月至 2021 年 3 月北京大学深圳医院住院患者临床样本分离的 61 株CRPA，菌株于-80 保存。1.2仪器与试剂Vitek2-Compact 全自动细菌鉴定和药敏系统（法国梅里埃），Vitek MS 质谱仪（法国梅里埃），CO2恒温培养箱（美国Thermo-311），药敏纸片（英国OX
13、IOD），哥伦比亚血平板、MH 平板（广州迪景），碳青霉烯酶缓冲液（珠海迪尔生物），碳青霉烯酶检测试剂盒（长沙中生众捷生物）。1.3质控菌株铜 绿 假 单 胞 菌 ATCC27853 与 大 肠 埃 希 菌 ATCC25922 为AST 药敏试验质控菌株，来自广东省临床检验中心。产KPC 肺炎克雷伯菌和产NDM 肺炎克雷伯菌为碳青霉烯酶试验质控菌，来自卫生部临床中心提供。1.4方法1.4.1CRPA 菌株鉴定和药敏试验采用Vitek-MS 质谱仪和Vitek2-Compact 全自动细菌鉴定和药敏系统，严格按照 全国临床检验操作规程操作进行细菌分离培养鉴定和药敏试验。药敏试验结果根据美国临床和
14、实验室标准协会 2020 版CLSIM10030th 标准判断。1.4.2 碳青霉烯酶初筛试验（1）EDTA 双纸片增效法：用无菌生理盐水调制麦氏浊度 0.5 的待测菌液，在MH 琼脂平板上均匀涂布。用灭菌镊子放置 4 张已平衡至室温的亚胺培南药敏纸片，纸片间距24 mm，纸片距平板边缘15 mm，在平板背面对应位置分别标记A、B、C、D。将试剂盒中缓冲液R1（乙二胺四乙酸二钠+氢氧化钠）、R2（3-氨基苯硼酸）平衡至室温，A纸片作为空白对照，B 纸片上滴加 10 L 缓冲液R1，C 纸片上滴加 10 L 缓冲液R2，D 纸片上分别滴加 10 L 缓冲液R1 和R2。孵育 1824 h 后取出
15、平板，测量B、C 纸片抑菌圈直径，分别与A 纸片对比，直径比A 纸片扩大5 mm，则分别表示该菌株产金属酶、产丝氨酸酶。（2）免疫层析法：样本和提取缓冲液在EP管中充分混匀后加到检测卡样本孔，样本中碳青霉烯酶与胶体金偶联的碳青霉烯酶单克隆抗体反应，在层析作用下沿着硝酸纤维素膜移动，与固定在检测卡检测线上的KPC、OXA-48、VIM、IMP 和NDM 型碳青霉烯酶单克隆抗体捕获，形成“抗体抗原-金标抗体复合物”，并在测试区相应检测线上出现 1 条或多条红线。1.4.3CRPA 耐药基因测序 将收集的菌株送至深圳市第一人民医院进行碳青霉烯酶耐药基因（KPC、OXA-50、VIM、IMP 和NDM
16、）检测。1.5统计学处理采用WHONET 5.6、Microsoft Excel 2020 及统计学软件SPSS 26.0 对实验数据进行统计分析，计数资料以菌株数及百分数表示。2结果2.1CRPA 的科室分布61 株CRPA 主要分布ICU 科室 24 株、普通病房37 株，其中检出率排行前 3 的是ICU 24 株（39.34%）、呼吸内科 9 株（14.75%）、脑外科 7 株（11.48%），其余包括神经内科 3 株，肾内科、胸外科、运动医学科各 2株，耳鼻喉病区、肝胆胰外科、急诊科、脊柱外科、泌尿外科、血液内科各 1 株，以及其他科室 6 株。2.2CRPA 的标本来源61 株 CRPA 的标本来源以痰液为主，共 49 株（80.33%），尿液 7 株（11.48%），腹水 2 株（3.28%），伤口分泌物、血液、引流物各 1 株（1.64%）2.3CRPA 耐药性分析亚胺培南和美罗培南的耐药率较高，分别达100.00%和 78.69%，其次为左氧氟沙星和替卡西林/克拉维酸，均为 60.66%，而氨基糖苷类药物阿米卡星耐药率最低，为 8.20%。其余抗菌药物耐药率见表 1。2
