1、通信作者，：；收稿日期：；修回日期：基金项目：内蒙古自治区科技重大专项（、）；内蒙古自治区奶牛疫病防控技术创新研发项目作者简介：郝彦儒（），男，山西运城人，硕士研究生，研究方向为动物疫情防控，：文章编号：（）牛副结核病的研究进展郝彦儒，谢梦圆，张园园，尚和卫，许燕飞，徐晓静，张娜，（内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古呼和浩特 ；内蒙古畜牧业协会，内蒙古呼和浩特 ；内蒙古自治区农牧业技术推广中心，内蒙古呼和浩特 ）摘要：牛副结核病是在世界范围内流行的、以牛肉芽肿性肠炎和进行性消瘦为主要特征的传染病，给畜牧生产造成了严重危害和巨大经济损失。牛副结核病由副结核分枝杆菌引起，致病机制复杂，传播方式多种多样
2、，病原体难以分离培养。对牛副结核病的致病机制及其致病菌躲避免疫系统方式进行综述，提出病料去污处理方法研究能更好地为分离培养和研究副结核分枝杆菌提供帮助，以期为牛副结核病的预防诊断和治疗提供理论指导。关键词：副结核；致病机制；去污方法中图分类号：；文献标志码：牛副结核病（）又称为约翰氏病（，）或牛副结核性肠炎，是由副结核分枝杆菌（.，）引起的一种慢性消耗性疾病。患病动物以肉芽肿性肠炎和进行性消瘦为典型特征，随着病程发展，患畜消瘦，骨感明显，高度营养不良而最终导致死亡。该病潜伏期极长，可达年；无明显季节性，亚临床状态下 会间歇性随着粪便排出体外，部分动物临床期病变不明显难以被发现淘汰，从而持续排出
3、 污染环境，引起其他健康动物感染。此病最易发生在牛身上，尤其是小牛。世界卫生组织将其列为法定报告传染病，需要强制通报，我国将其定为二类动物疫病。该病流行于世界很多国家，我国于 年在内蒙古自治区首次发现此病。目前，该病没有有效的治疗办法，在疫苗开发方面也没有突破性进展，同时由于 具有躲避动物机体先天免疫功能的能力，可长期潜伏于病畜体内难以被发现，所以通过对 致病机制进行深入研究可能会为 的防治提供很好的解决思路。除此之外，由于 生长缓慢，生长条件苛刻，在培养过程中极易因受到污染而导致培养失败。目前，国内外通用方法是对样品提前做去污处理，以最大程度保证 生长过程中不被污染。近年来，国内外对 致病机
4、制和 培养时的去污处理做了很多探索，本文对这两方面的近年研究进行综述，以期为牛副结核病的深入研究提供参考。病原特性副结核分枝杆菌是一种胞内寄生菌，革兰阳性，呈短杆棒状，菌落呈颗粒状，乳酪色或黄色；不易被普通方法染色，常用 染色法（抗酸染色法）；镜检时呈现红色棒状聚集，大小约 ，为需氧菌；最适生长温度，最适 值为。生长极其缓慢，世代时间超过 ，对外界抵抗能力较强，排出体外后能在土壤和水源中存活数月甚至一年，这也是该病能够长期传播并难以清除的原因之一。的初代分离非常困难，年 和 在 牛 的 慢 性 肠 炎 病 例 中 首 次 观 察 到，因此最早称为约氏菌。无法在普通的培养基上分离培养，但有研究表
5、明 能够在添加干燥灭活的结核分支杆菌并含鸡蛋的培养基中良好生长。后来的研究证明，生长所必需的生长因子是分支杆菌素，是由分枝杆菌属细菌产生的一种能够强力螯合铁的天然物质。分支杆菌素有多种，最早被提取且用于 培养的是分支杆菌素，年研究者从已经适应实验室培养的 中提取了分支杆菌素。除去需要特殊物质分枝杆菌素来促进生长以外，初代分离培养面临的困难还包括：样品采集的部位背景杂菌多；接种培养后因培养周期过长导致的污染问题；实验操作必须严格以及良好的样品处理方式等。年月第期兽医导刊 流行病学调查通常认为，牛副结核杆菌的感染发生于新生犊牛，主要是通过粪口途径感染。临床期和亚临床期的病牛都可以通过粪便将病原体排
6、出体外，从而造成 污染牛群的生活环境，包括土壤、水源、畜舍等，犊牛在摄入初乳或牛乳时，由于吸吮到母牛乳房皮肤表面沾染的环境中的病原体从而发生感染；另外 能够侵入乳房存在于牛乳中，在经过巴氏消毒法处理过的牛奶中检测到了。病原体 也可以通过其他的方式传播，如子宫传播、精液传播，这表明有些犊牛在胎儿期间就可能感染。除此以外，有研究发现 可以通过其他体液如唾液转移，也可以通过气溶胶的形式吸入感染，这使得牛副结核病的防控更加困难。除了牛群内部由病牛导致的传播以外，感染或携带 的野生动物甚至昆虫如甲虫、蝇也会造成水平传播，但近年来相关研究报道并不多见，牛群内部的传播是主要原因。感染机制 进入机体后侵入到肠
7、道巨噬细胞，并在巨噬细胞内存活并繁殖，最后返回肠道上皮细胞随粪便排出体外。从进入机体开始到侵入巨噬细胞内部的过程分两个功能性阶段，第一个阶段：侵入到肠道部位，这一阶段可能有多种途径；第二个阶段：在巨噬细胞中感染并存活下来。入侵到肠道部位 需要突破肠道黏膜才能侵入巨噬细胞，这一过程非常短暂，在几分钟至几小时就可完成。早期研究认为，从口腔进入后首先经扁桃体隐窝侵入机体，在感染最初的几天先经血液传播向全身各处扩散，然后才开始趋向于肠道及相关的淋巴结等部位。但近年 等在 牛口腔感染模型试验中发现，扁桃体并不是 首先的入口，病原体是先侵入肠道组织，后经淋巴液或血液逐步扩散至肠黏膜及肠外组织，感染模型中空
8、肠、回肠两部位的 浓度最高，这对 采样点的选择非常具有价值。肠道上皮细胞首先通过固有结构组织来抵抗 的入侵，病原体突破这一障碍可通过两种方式：一种是通过微皱褶细胞（细胞）；一种是通过肠上皮细胞。细胞是多种肠道致病菌的侵入口，除 以外，大肠杆菌、霍乱弧菌、沙门菌和志贺菌等均由此侵入机体。派尔斑（，）是由小肠内的一组淋巴滤泡组成的肠黏膜免疫系统的重要组成部分，细胞覆盖在其表面。细胞利用 中 能 特 异 性 识 别 抗 原 的 细 胞 来 主 动 吸 收。等 通过牛不同肠段的 感染模型发现，不同肠段的 对 入侵所产生的免疫应答反应存在显著差异，这为进一步研究 通过 细胞侵入机体拓宽了方向。细胞利用
9、吸收 后，上的纤连蛋白与细胞上的纤连蛋白受体构成纤连蛋白桥，很容易就通过 细胞进而被巨噬细胞吞噬，因此这种方式也被认为是优先摄取 的方式。第二种是通过肠上 皮 细 胞 入 侵，是 一 种 非 纤 连 蛋 白 的 机 制，进入肠上皮细胞中后，细胞内形成吞噬体包裹住 ，这会刺激白介素（）促炎因子的产生和释放，使巨噬细胞跨上皮迁移，聚集到上皮下部位，从而使 从肠上皮释放后更易被巨噬细胞捕获。还会通过破坏细胞间连接使肠上皮细胞之间的连接从紧密变得松散，从而经细胞间隙突破肠黏膜屏障。进入巨噬细胞 被巨噬细胞摄取后激起免疫反应，如果巨噬细胞成功消灭被吞噬的 ，感染则中止；如果巨噬细胞没能及时清除，就会藏在
10、巨噬细胞中与机体的免疫系统进行长期斗争。副结核病的发展及机体的免疫反应副结核病的分期 感染分期 与机体的斗争过程可大致分为早期、中期和晚期三个时期。在感染的早期，宿主防御系统可以抑制 发展，无法扩散仅局限于某些部位缓慢增殖，这一过程对应牛副结核病的潜伏期，感染牛不表现任何症状同时也不排出病原体，常用的检测方法难以检测，这一时期可以长达两年甚至更久。虽然早期感染过程中 会被免疫系统限制，但为了对抗感染，机体内大量的炎性细胞如巨噬细胞、中性粒细胞等大量聚集，形成局灶性的肉芽肿使局部肠黏膜增厚。随着感染的持续发生，在机体免疫斗争中占据上风，牛副结核病发展到亚临床阶段，病畜会间歇性的将病原体随粪便排出
11、体外。由于间歇性排出及排菌量少，疾病难以被发现。疾病进入临床期，大量繁殖后返回肠上皮并兽医导刊 年第期排出体外，典型病症出现，肠道及其黏膜病变更加严重，肉芽肿性肠炎开始呈弥散性分布而不再是局灶性病变，最终成为牛副结核病的典型病症。肠绒毛由于大量炎性细胞浸润形态改变，对营养物质的吸收效率极大降低，病畜营养不良导致骨感明显。肠道内蛋白等物质无法吸收导致低蛋白血症和水样腹泻，如果碰到分娩及哺乳期还会加重症状，产奶量会大幅度降低甚至无法产奶，严重影响生产效益。侵入机体后的免疫反应 开始侵袭巨噬细胞后，巨噬细胞吞噬与清除病原体，并作为抗原呈递细胞触发下游的细胞免疫和体液免疫反应。在这一过程中，识别巨噬细
12、胞受体、吞噬体成熟、自噬以及逃逸机制等步骤是免疫网络的重要组成部分。病原体表面特定的分子结构被称为病原体相关分子模式（），巨噬细胞表 面 具 有 能 够 识 别 的 模 式 识 别 受 体（）。识别病原体的，通过下游信号，调节 各 种 免 疫 反 应 基 因 的 表 达 来 清 除 病 原 体。被吞噬过程中第一个遇到的就是巨噬细胞表面 ，包括 受体，与调理素相关的受体如 受体、整合素及补体受体（）、不受调理作用的受体如 、型凝集素（，、甘露糖受体、）以及清除剂受体等，这些受体均会参与 免疫反应。有多项研究认为，补体受体与巨噬细胞优势性摄取病原体有关，这表明巨噬细胞通过补体受体免疫 机制可能是
13、躲避免疫的一种重要途径。被吞噬后，巨噬细胞需要依赖 、伽马干扰素（）及肿瘤坏死因子（）等来激活自身提高杀菌活性，增强杀菌肽和其他具有杀菌能力的物质如一氧化氮、活性氧的产生。另外，被吞噬后形成并成熟为吞噬体，再与胞内溶酶体融合为吞噬溶酶体杀灭 。具有逃逸免疫系统的能力，这也是 能够在一系列免疫反应后成功存活并繁殖的根本原因。可以通过抑制或者拮抗机体溶酶体降解病原体的机制存活，以抗菌肽（）为例，是体内唯一具有中和内毒素作用的抗菌肽，研究表明非结核分枝杆菌的磷脂成分具有拮抗 的能力。另外，还可以通过控制巨噬细胞的死亡以及夺取营养来逃避机体免疫。虽然 入侵机体突破肠黏膜后，巨噬细胞是主要的靶细胞，但最
14、近研究表明嗜中性粒细胞也会在感染的早期阶段为清除 做出贡献。嗜中性粒细胞是一种寿命短暂的细胞，通过产生活性氧、溶解酶以及嗜中性粒细胞胞外陷阱来杀灭病原体，其中嗜中性粒细胞胞外陷阱机制是近年来新发现的一种重要的新型效应机制。等 通过使用 与牛分枝杆菌卡介苗感染的单独培养及共培养的嗜中性粒细胞，评估了免疫过程中嗜中性粒细胞胞外陷阱、病原体杀灭及促炎因子的产生，结果显示胞外陷阱这一机制对于机体杀伤 同样具有作用，这也是首次关于嗜中性粒细胞在胞外陷阱机制上对于 研究的报道，对进一步研究 引发机体免疫反应及预防、检测 和开发药物等方面都有重要价值。培养前去污处理样品选择 能够在患病动物体内多种组织被检测
15、出来，因此取样选择有多种。进行常规流调或疑似病畜检查时，常采取外周血、牛乳及直肠采集粪样等。直肠采集粪样是分离培养 最常见方式，血液、牛乳采集前应对采集部位做好皮肤表面消毒工作，使用碘伏或 酒精进行擦拭。粪便采集应使用干燥、干净的检查手套从直肠采集粪便，对于病畜剖检取材，除了采外周血、牛乳等，还可采集内脏器官、肌肉及肠道淋巴结等组织，具体包括肝脏、肾脏、淋巴结（腘窝淋巴结、肩胛前淋巴结、腹股沟淋巴结、回盲肠淋巴结）等。有研究对肌肉组织进行采样，结果表明不同部位 数量是有差异的。由于 本身生长速度缓慢，在长期的培养周期中为尽可能避免杂菌的污染，采样后会进行去污处理，而去污处理不仅会消灭杂菌，同时
16、也会对 数量和活性产生影响，因此应当首选空肠、回肠、肠系膜淋巴结、回盲部淋巴结等 数量较多的部位。样品采集将样品采集后分别放入干净、密闭的容器，贴上标签做好标记。样品应在装有冷藏冰袋的隔热容器中运输，防止运输过程中极端温度的变化，尽早送至实验室保存或进行后续试验。样品采集后应在 内进行处理，如果无法尽早处理，应将样品 冷冻保存，当有条件或需要取样时，可置于 水浴锅或培养箱中快速解冻。应当注意的是，样品应尽可能避免反复冻融，有研究显示样品反复冻融会降低实验室培养的 的可检测率，当使用液体郝彦儒谢梦圆张园园等牛副结核病的研究进展培养基 和固体培养基 时，细菌生长分别减少了 和 。样品去污及接种前处理不论使用哪种来源的样本来进行 培养都携带有能够干扰 生长的杂菌，包括细菌、真菌等，因此，样品的去污处理是 分离培养前的关键步骤。为防止这部分杂菌在 培养过程中的干扰，目前国内外通用的处理方式是在样品接种培养基之前，使用对细菌有消杀作用的化合物或抗生素进行前处理，以最大程度抑制杂菌生长，同时尽可能不影响或最小程度地影响 生长能力。关于净化步骤，早期国外的研究者采用过包括草酸、次氯酸钠、氢氧化钠、苯
