1、山东医药2023 年第 63 卷第 8 期脑胶质瘤组织中透明质酸合成酶2表达变化及其与临床病理参数和预后的关系薛正淳1，2，孙强1，孟祥龙1，张健2，张墨轩3，衡雪源21 潍坊医学院研究生院，山东潍坊261053；2 临沂市人民医院神经外科；3 北京市神经外科研究所 首都医科大学附属北京天坛医院功能神经外科研究室摘要：目的观察脑胶质瘤组织中透明质酸合成酶2（HAS2）的表达变化，探讨HAS2表达与脑胶质瘤临床病理参数及预后的关系。方法收集行脑胶质瘤切除术患者的胶质瘤组织标本70例纳入病例组，肿瘤WHO分级1 2级32例、3 4级38例。另收集同期行颅内减压术的脑外伤患者的脑组织标本10例纳入对
2、照组。分别采用免疫组化法及Western blotting法检测两组HAS2蛋白，分析HAS2表达与脑胶质瘤临床病理参数的关系。采用Logistic回归分析胶质瘤组织中HAS2表达量的影响因素。绘制Kaplan-Meier生存曲线，比较不同HAS2表达水平的脑胶质瘤患者的预后。结果免疫组化检测结果与Western blotting检测结果均显示，病例组HAS2表达高于对照组，且3 4级脑胶质瘤组织中HAS2表达高于1 2级脑胶质瘤组织（P均0.05）。WHO分级3 4级、突变型p53、Ki-67高表达脑胶质瘤组织中HAS2高表达率分别高于1 2级、野生型p53、Ki-67低表达的肿瘤组织（P均
3、0.05）。将WHO分级、Ki-67表达、p53分型、年龄、性别、肿瘤部位和O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶表达作为自变量，将HAS2表达作为因变量，纳入Logistic回归模型分析，结果显示WHO分级、Ki-67表达与p53分型是脑胶质瘤患者HAS2表达的独立影响因素（P均0.05）。HAS2高表达患者的平均生存时间、总生存率低于HAS2低表达患者（P均0.01）。结论HAS2在脑胶质瘤组织中高表达，HAS2高表达与脑胶质瘤恶性程度有关，并影响患者预后。关键词：透明质酸合成酶2；脑胶质瘤；Ki-67；p53doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2023.08.015 中
4、图分类号：R739.41 文献标志码：A 文章编号：1002-266X（2023）08-0061-04胶质瘤是最常见的颅内原发性肿瘤，约占颅内恶性肿瘤的81%1-3。目前手术切除联合术后放化疗是脑胶质瘤常用的治疗方法4，但由于脑胶质瘤细胞生长迅速、侵袭性高、易复发或产生耐药，治疗效果仍不理想。研发新的治疗策略是胶质瘤治疗相关研究的重点5-6。近年来分子靶向治疗研究进展迅速，许多与胶质瘤诊断、治疗和预后相关的基因被筛选出来。透明质酸合成酶 2（HAS2）定位于染色体 8q24.13，是透明质酸合成酶家族中的一员。透明质酸连同其表面受体已被证实与恶性肿瘤进展（如侵袭和转移）有关7-8。多项研究表明
5、，HAS2与基金项目：山东省医药卫生科技发展计划项目（202104040538）；临沂市科技发展计划项目（202120064）。通信作者：衡雪源（E-mail：）17MARX S，DAL MASO T，CHEN J W，et al.Transmembrane（TMEM）protein family members：poorly characterized even if essential for the metastatic process J.Semin Cancer Biol，2020，60：96-106.18杨明会.TMEM39A基因多态性及其表达与原发性胆汁性胆管炎、系统性红斑狼疮及
6、桥本氏病的关联性研究 D.大连：大连医科大学，2021.19HITOMI Y，UENO K，KAWAI Y，et al.POGLUT1，the putative effector gene driven by rs2293370 in primary biliary cholangitis susceptibility locus chromosome 3q13.33 J.Sci Rep，2019，9（1）：102.20WAGNER M，SOBCZYNSKI M，BILINSKA M，et al.Preliminary study on the role of TMEM39A gene in
7、multiple sclerosisJ.J Mol Neurosci，2017，62（2）：181-187.21WEETMAN A P.An update on the pathogenesis of Hashimotos thyroiditis J.J Endocrinol Invest，2021，44（5）：883-890.22ZHANG Z，LUO S，BARBOSA G O，et al.The conserved transmembrane protein TMEM-39 coordinates with COPII to promote collagen secretion and
8、regulate ER stress response J.PLoS Genet，2021，17（2）：e1009317.23KONG M，MA T，XIANG B.ANKRD1 and SPP1 as diagnostic markers and correlated with immune infiltration in biliary atresiaJ.Medicine（Baltimore），2021，100（50）：e28197.24KONG M，XIANG B.Identifying biomarkers to predict the prognosis of biliary atr
9、esia by weighted gene co-expression network analysis J.Front Genet，2021，12：760182.（收稿日期：2023-01-04）61山东医药2023 年第 63 卷第 8 期结直肠癌、胰腺癌、子宫内膜癌的肿瘤分级和患者预后有关9-11。一项回顾性分析也显示，HAS2在浸润性星形细胞胶质瘤中高表达12。本研究观察了脑胶质瘤组织中HAS2的表达变化，探讨HAS2表达与脑胶质瘤临床病理参数及预后的关系。现报告如下。1 资料与方法 1.1临床资料选取2013年7月2020年7月在临沂市人民医院行脑胶质瘤切除术患者的胶质瘤标本 70
10、例纳入病例组，患者男 37 例、女 33 例，年龄2 70 岁，WHO 分级 1 2 级 32 例、3 4 级 38 例。纳入标准：经术后病理证实为脑胶质瘤；患者具有手术指征，且自愿手术；术前未进行放化疗、免疫治疗等。排除患有其他恶性肿瘤或二次胶质瘤手术的患者，病例资料缺失的患者，围术期死亡者。另选同期行颅脑外伤减压手术的脑外伤患者的正常脑组织10例纳入对照组。对照组患者男6例、女4例，年龄16 72岁。两组患者一般资料差异无统计学意义，具有可比性。本研究获得医学伦理委员会批准，患者及家属均签署知情同意书。1.2HAS2蛋白检测1.2.1免疫组化法标本组织获取后经多聚甲醛固定，石蜡包埋，4 m
11、 厚切片，烘片机 70 烘烤45 min；切片经常规脱蜡水化，置于柠檬酸盐修复液中进行抗原修复，冷却至室温移至湿盒；加入内源性过氧化物酶阻断剂静置 15 min，PBS 冲洗 3 次；滴加 1100稀释的 HAS2抗体，孵育过夜后 PBS漂洗3次；滴加反应增强液室温孵育20 min，PBS冲洗3次；滴加抗鼠/兔 IgG二抗，室温孵育 40 min；加入新鲜配置的二氨基联苯胺（DAB）显色液，流动水冲洗；苏木素复染，脱水，透明，干燥，中性树胶封片。显微镜下（200）观察，每个切片随机选取10个视野，计数阳性细胞数。根据HAS2染色程度和阳性细胞百分比评估结果：染色程度为无染色、淡黄色、棕黄色、褐
12、黄色分别计0、1、2、3分，HAS2阳性细胞百分比为0、25%、25%4为HAS2高表达。1.2.2Western blotting 法两组组织在液氮作用下研磨，全蛋白提取试剂混匀后提取总蛋白，BCA蛋白定量；配置10%分离胶，4%浓缩胶上样电泳，浓缩胶恒压80 V，分离胶恒压120 V，恒流280 mA转膜70 min；将转膜后的聚偏氟乙烯膜放入新鲜配置的牛奶中封闭2 h，后加入1 1 000稀释的HAS2抗体，放置4 冰箱孵育过夜；次日PBST洗膜3次，加入抗兔酶标记二抗，摇床孵育2 h，PBST洗膜；吸取显影液均匀滴于膜上进行化学发光显影，得到Western blotting条带；用Im
13、age J软件分析条带，得到条带灰度值。以目的蛋白条带灰度值与内参GAPDH蛋白条带灰度值的比值表示目的蛋白相对表达量。1.3统计学方法采用 SPSS26.0 软件及 GraphPad Prism9软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料以-x s表示，组间比较采用t检验。计数资料用百分比（%）及频数表示，组间比较采用2检验。采用Logistic回归模型分析HAS2表达的影响因素。采用Kaplan-Meier曲线描述患者生存情况，生存期差异比较采用Log-Rank检验。P0.05为差异有统计学意义。2 结果 2.1两组 HAS2蛋白表达比较免疫组化法检测结果显示，HAS2主要在细胞质中表达，为
14、淡黄色至黄褐色颗粒。见图 1。病例组 HAS2 高表达 38 例（54.2%，38/70），其中1 2级、3 4级脑胶质瘤组织HAS2高表达分别为11例（34.4%，11/32）、37例（71.1%，27/38）；对照组 HAS2 高表达 1 例（10%，1/10）。病例组HAS2高表达率高于对照组，且3 4级脑胶质瘤组织中HAS2高表达率高于1 2级脑胶质瘤组织（P均0.05）。Western blotting检测结果显示，病例组、对照组HAS2相对表达量分别为0.803 0.286、0.243 0.108，其中1 2级、3 4级脑胶质瘤组织HAS2相对表达量分别为0.355 0.109、0
15、.765 0.081。病例组HAS2相对表达量高于对照组，且3 4级脑胶质瘤组织中HAS2相对表达量高于1 2级脑胶质瘤组织（P均0.05）。2.2HAS2 表达与脑胶质瘤临床病理参数的关系WHO分级3 4级、突变型p53、Ki-67高表达脑胶质瘤组织中HAS2高表达率分别高于1 2级、野生型 p53、Ki-67 低表达的肿瘤组织（P 均0.05）。HAS2表达与患者年龄、性别、肿瘤位置、O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT）表达无相关性。见ABCDEF注：A对照组；B、C、D、E分别为病例组中1、2、3、4级胶质瘤组 织；F为阴性对照。图1两组HAS2表达情况（免疫组化法）62山东医
16、药2023 年第 63 卷第 8 期表1。将WHO分级、Ki-67表达、p53分型、年龄、性别、肿瘤部位和MGMT表达作为自变量，将HAS2表达作为因变量，纳入Logistic回归模型分析，结果显示WHO分级、Ki-67表达与p53分型是脑胶质瘤患者HAS2表达的独立影响因素（P均0.05）。见表2。2.3HAS2表达与胶质瘤患者生存时间及预后的关系随访至2020年12月，病例组70例患者死亡37例、存活33例，存活率为47.1%。HAS2高表达患者的平均生存时间（33.6个月）、总生存率（28.9%）低于HAS2低表达患者（分别为43.5个月、62.5%），P0.01。见图2。3 讨论 原发性中枢神经系统肿瘤的发病中位年龄约为60岁，其中胶质瘤约占26%13。尽管胶质瘤有很多治疗方案，包括手术治疗、化疗、放疗和免疫治疗，但胶质瘤患者的生存率仍然很低。可能原因是肿瘤的异质性和表观遗传学的复杂性使胶质瘤的治疗靶点难以确定，生理性血脑屏障的存在也限制了药物的效果。此外，肿瘤的高浸润性也使手术治疗的效果有限。现已明确肿瘤标志物可作为胶质瘤诊断和治疗的分子依据14。近年来与恶性肿瘤相关的细胞外
