1、基础研究苗药杆努尽烟对慢性阻塞性肺疾病大鼠糖皮质激素耐药作用的分子机制占雅婷，雷昆彧，刘娇娇，吴宁（贵州医科大学 基础医学院化学与生物化学实验室，贵州 贵阳）摘 要目的 探讨苗药杆努尽烟对慢性阻塞性肺疾病（）大鼠糖皮质激素耐药作用的分子机制。方法 称取杆努尽烟全草制取水提物，选取 只（）大鼠作为对照组（正常饲养），只大鼠采用烟熏结合脂多糖（）气管注射法，制作 大鼠模型并随机均分为模型组（生理盐水灌胃）、杆努尽烟组（杆努尽烟水提液灌胃）、地塞米松组（雾化吸入地塞米松）及联合用药组（杆努尽烟灌胃联合地塞米松雾化吸入），造模同时给予相应药物干预 麻醉取心脏血，采用酶联免疫吸附试验（）检测各组大鼠血清
2、白细胞介素（）的水平；处死大鼠，取肺组织采用苏木精伊红染色（）法观察各组大鼠肺组织的组织学特征，并采用实时荧光定量聚合酶链反应（）和免疫印迹法（）测定各组大鼠肺组织中 促分裂素原活化蛋白激酶（）、受体（）及热休克蛋白（）和蛋白的表达。结果与对照组相比，杆努尽烟组、地塞米松组、模型组及联合用药组 大鼠均有不同程度的喘息、咳嗽、精神状态不佳，其中联合用药组呼吸系统症状最轻；杆努尽烟组、地塞米松组血清 含量较模型组降低（.），杆努尽烟组、地塞米松组及联合用药组 大鼠肺组织、及 和蛋白表达较模型组降低（.）。结论 苗药杆努尽烟可改善 大鼠 耐药作用，减轻肺组织炎症细胞浸润、降低血清 水平，其机制可能与
3、下调 含量提高、表达有关。关键词糖皮质激素类；丝裂原活化蛋白激酶类；阻塞性肺疾病，慢性；糖皮质激素抵抗；糖皮质激素受体；热休克蛋白；杆努尽烟中图分类号.文献标识码 文章编号（）：，（，）（）（）（）（），（）（），（），（），第 卷 第 期 年 月 贵 州 医 科 大 学 学 报 基金项目国家自然科学基金（）；年省级本科创新训练项目（）贵州医科大学 级本科生通信作者：引用本文：占雅婷，雷昆彧，刘娇娇，等 苗药杆努尽烟对慢性阻塞性肺疾病大鼠糖皮质激素耐药作用的分子机制 贵州医科大学学报，（）：（）（）（）（）（）（），（）（），（.），（），；，；慢性阻塞性肺疾病（，）是目前世界上影响人类生活质
4、量的 大慢性病之一。糖皮质激素（，）作为一种高效的抗炎药物，广泛应用于 的临床治疗，但部分病人出现了不敏感现象而导致疗效不佳。近年来随着对 药物耐药机制研究的不断深入，丝裂原活化蛋白激酶（，）信号通路被认为在 抵抗中承担不可或缺的桥梁作用，相关的上下游因子及基因位点参与调控 抵抗。一方面，信号通路与 受体（，）相互调节介导炎症因子的激活；另一方面，信号通路影响 对 的敏感性。近年来，植物化学物质和传统化疗药物的组合疗法逐渐应用于 患者的耐 治疗，且有一定的疗效。杆努尽烟是贵州苗族地区治疗 的传统药物，应用历史悠久、疗效独特、毒副作用小，尚处于经验用药阶段。课题组前期研究已经证明，杆努尽烟可通过
5、调节 上游的 样受体 髓样分化因子（，）介导相关炎症通路，减少炎症因子的分泌，降低气道炎症反应。本研究采用杆努尽烟、地塞米松及两者联合用药对 大鼠进行对比治疗，观察大鼠肺组织的病理变化、白细胞介素（，）含量及、热休克蛋白 （，）、及蛋白质的表达，探究苗药杆努尽烟对 大鼠 治疗的敏感性的潜在作用机制，为该药的开发利用提供一定的实验基础。材料与方法.实验材料.动物及药物来源 只清洁 （）级、周龄（）大鼠，雌雄各半，体质量（），由学校动物中心提供（黔）；杆努尽烟全草采摘于凯里市炉山镇，经贵州省中医药大学潘炉台教授鉴定属植物吊石苣苔（.），地塞米松磷酸钠注射液（贵州天地药业，国药准字）。期占雅婷等 苗
6、药杆努尽烟对慢性阻塞性肺疾病大鼠糖皮质激素耐药作用的分子机制.主要试剂及仪器 遵义牌香烟，脂多糖（，；美国），热休克蛋白（，）兔抗大鼠一抗、（华安生物），兔抗大鼠一抗、兔抗大鼠一抗，辣根过氧化物酶（，）标记山羊抗兔免疫球蛋白（，）二抗（美国 公司）；实时荧光定量 仪（美国 ），超微量紫外可见光分光光度计（美国），凝胶成像系统（英国），全自动生化分析仪（美国），涡旋震荡仪（美国 ），高压消毒锅（日本），台式高速离心机（美国），超速离心机（美国 ）。.实验方法.苗药杆努尽烟水提液的制备 大鼠与人用药体表面积换算得需制取 的杆努尽烟水提物。称取杆努尽烟全草 ，纱布包裹，置于恒温水浴箱，水至淹没药材，
7、连续提取 ；收集、过滤、旋蒸水提液，浓缩成 的杆努尽烟水提物，分装药液于 冰箱储藏。.大鼠分组及 大鼠模型的建立大鼠采用随机分为对照组、模型组、杆努尽烟组、地塞米松组及联合用药组，只 组，适应性饲养，对照组置于正常无烟环境中常规饲养，后 组大鼠置于自制被动吸烟染毒箱（，上壁留有通气孔、将 针筒改装为体外吸烟装置），采用烟熏结合 气管注射法复制 大鼠模型；造模需 ，第 天和第 天以 水合氯醛（.）腹腔内注射麻醉大鼠，气道内注射 溶液.，当天不予香烟烟熏，其余时间烟熏 次（每箱放置 个进烟口），次、早晚各 次；造模结束后，每组取 只大鼠肺部标本制作苏木精 伊红染色法（，）切片，在光学显微镜下，观察
8、完整的中小支气管横断面，切片见部分支气管、肺泡坏死，上皮细胞坏死脱落于管腔，胞核溶解，坏死区见炎性细胞浸润，以淋巴细胞为主，伴少量纤维组织增生，提示造模成功。.给药干预 各组大鼠适应性喂养 、开始造模时即给予干预：对照组大鼠不作任何处理，正常饲养；模型组大鼠用生理盐水灌胃，次、只，共 ；杆努尽烟组大鼠用杆努尽烟水提液灌胃，次，共；地塞米松组大鼠雾化吸入地塞米松，次、.只，共 ；联合用药组大鼠用杆努尽烟灌胃联合地塞米松雾化吸入，杆努尽烟 、地塞米松.只，共。.观察指标.呼吸系统症状观察及肺组织的收集 观察实验过程中 组大鼠呼吸系统症状，包括有无喘息、咳嗽、体质量减轻、活动量减少及毛发光泽度下降等
9、。组大鼠腹腔注射麻醉剂水合氯醛后心脏取血，血液样本旋转离心制得血清，用于酶联免疫吸 附 试 验（，）检测；取血后注射过量麻醉剂处死，取肺组织，用生理盐水冲洗后，左肺上叶固定于 甲醛，右肺经液氮处理后置于 冰箱保存，用于后续指标检测。.大鼠肺组织切片组织学变化取“.”项下各组大鼠肺门根部取组织 固定于 多聚甲醛溶液，经脱水、修剪、包埋、切片、染色、封片后镜检。.大鼠肺组织中 含量 取“.”项下各组大鼠新鲜肺组织 ，剪碎，加磷酸缓冲盐溶液（，）于研磨器中充分研磨，的条件下 离心 ，取上清液，按照 试剂盒说明书检测 表达水平。.大鼠肺组织、及 表达 取“.”项下各组大鼠肺组织样本后，制备肺组织匀浆，
10、提取总，对 浓度的测定及逆转录；逆转录的 进行 扩增，凝胶电泳后进行凝胶图像分析；法提取主动脉总，提取的 通过 超微量分光光度计测定其浓度和纯度，通过凝胶电泳测定 完整度；使用逆转录试剂盒以 为模板合成互补脱氧核糖核酸（，），其中，孵育条件为 、，终止反应条件为 ，设计引物和引物序列见表。反应条件为 ，、个循环，；反应完成后，测定扩增循环数（，）、熔融曲线（每个样品重复检测 次）；以甘油醛磷酸脱氢酶（，）为内参，用 法计算各基因的相对表达量；扩增后，凝胶电泳后进行凝胶图像分析。贵 州 医 科 大 学 学 报 卷表 、及 引物序列 ，名称引物序列分子量上游 下游上游下游上游下游上游下游.大鼠肺组
11、织、及 蛋白表达取“.”项下各组大鼠肺组织 充分淹没于裂解液 ，二辛可宁酸含量测定（，）蛋白浓度检测定量蛋白浓度；取总蛋白 ，样品缓冲液配平上样液，沸水浴 ；配置 分离胶、浓缩胶，凝固胶后拔出梳齿上样；十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳（，）电泳，浓缩胶 、，分离胶、；根据分子量大小进行切胶，聚偏二氟乙烯膜（，）膜转膜，、恒流；三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水与补间液（，）加至脱脂奶粉封闭 ，一抗孵育过夜；漂洗液洗 膜 次，次，加二抗配制液，摇床孵育 ；取膜，回收二抗，溶液洗涤 次，次；膜置于增强型化学发光剂（，）液中，用凝胶成像系统显影并分析条带灰度值，比较各目的条带与 的蛋白相对表达量。.统计学分
12、析应用 .软件进行统计分析，结果用均数 标准差（）表示；行两因素分析设计资料的方差分析及单因素方差分析，运用 检验比较各组均数总差异；方差不齐则 法方差分析和 多重比较；.差异有统计学意义。结果.呼吸系统症状与对照组相比，杆努尽烟组、地塞米松组、模型组及联合用药组大鼠均有不同程度的喘息、咳嗽、精神状态不佳，其中联合用药组呼吸系统症状最轻。.大鼠肺组织的特征给药 结束时，对照组大鼠肺组织见各级支气管结构正常，支气管纤毛上皮排列整齐，肺泡上皮细胞正常，肺间质未见明显纤维组织增生及炎性浸润；模型组大鼠肺组织见支气管结构受损，管腔狭窄，局部肺泡隔轻微增厚，支气管上皮细胞脱落，管腔内可见脱落细胞碎片，支
13、气管或血管周围可见大量淋巴细胞浸润；杆努尽烟组大鼠肺组织见支气管结构轻度变形，上皮细胞少量脱落，炎细胞增生情况缓解；地塞米松组大鼠肺组织支气管结构改变，部分纤毛上皮脱落，少量淋巴细胞和泡沫细胞浸润；联合用药组大鼠肺组织见支气管上皮细胞脱落有所改善，炎细胞增生情况缓解。见图。注：绿色箭头表示炎细胞浸润，黄色箭头表示泡沫细胞。图 各组大鼠肺组织切片（，）（，）.血清 含量 法检测结果显示（表），模型组、杆努尽烟组、地塞米松组和联合用药组大鼠血清 含量均较对照组明显升高（.），其中，联合用药组 指标最接近对照组水平；与模型组相比，杆努尽烟组、地塞米松组大鼠血清 含量均降低（.）。期占雅婷等 苗药杆努
14、尽烟对慢性阻塞性肺疾病大鼠糖皮质激素耐药作用的分子机制表 各组大鼠血清中 水平（）（）组别 （）对照组.模型组.（）杆努尽烟组.（）地塞米松组.（）联合用药组.（）注：（）与对照 组比较，.；与 模 型 组 比 较，（）.，（）.。.肺组织中、及 的表达给药第 天时，与对照组比较，其余各组大鼠肺组织中、及 表达升高（.），以模型组增加最为明显；与模型组相比，各给药组大鼠肺组织、及 表达有不同程度降低（.），其中以联合用药组降幅最大。见图。注：（）与对照组比较，.；（）与模型组比较，.。图 各组大鼠肺组织、及 表达 ，.肺组织中、及 蛋白的表达 法检测结果显示（图），与对照组相比，模型组、杆努尽
15、烟组、地塞米松组及联合用药组大鼠肺组织中、表达均上升，其中联合用药组最接近对照组水平（.）；与模型组相比，杆努尽烟组、地塞米松组及联合用药组大鼠肺组织 蛋白表达均接近对照组，其中联合用药组相对表达最少（.）。讨论临床中，药物因具有强大的抗炎作用，而被广泛应用于慢性气道炎症的治疗，发挥其抗炎、抗免疫的作用，。但是部分患者存在对激素不敏感或抵抗现象，不利于疾病的治疗和病情的控制。信号通路可被广泛炎症因子激活，其是促炎细胞因子转录和翻译分子水平上关键的信号调节通路，这使得 同路的不成组成部分称为治疗自身免疫性和炎症性疾病的潜在靶点，。人类 的丝氨酸 号位处有一个共识的 磷酸化序列，这可能是 信号通路
16、对 的直接影响位点。贵州省苗药资源丰富，苗族习惯用杆努尽烟治疗，疗效显著，且苗药具有对成分、多靶点、多途径及低毒副作用等特点。现代药理学研究表明，杆努尽烟中含有黄酮类、苯乙醇类、谷甾醇及熊果酸等有机化学成分，有良好的抗炎止咳作用，。本研究在前期研究的基础上，进一步探究杆努尽烟是否通过 信号通路途径改善 对 疗效，并为其临床应用提供理论支持和基础数据。本研究结果显示，联合药物组治疗后，大鼠肺部病理状态得到一定的改善，支气管上皮细胞脱落减少，炎症细胞数有所下降；与杆努尽烟组和 组相比，联合用药组大鼠肺组织匀浆中 表达下调，、表达升高（.），提示杆努尽烟能降低 的表达含量，并抑制 的分泌，在一定程度上局限炎症蔓延，提高 大鼠 治疗的敏感性。据此推测，杆努尽烟可能是通过干预 的分泌、抑制 的活性、增加 与 等解离及自身构像的改变启动核转位信号，进而增加激素和脱氧核糖核苷贵 州 医 科 大 学 学 报 卷注：为 法检测结果，为 法定量结果；（）与对照组比较，.；（）与模型组比较，.。图 各组大鼠肺组织、及 蛋白表达 ，酸 效应元件（，）的结合稳定性、核转移能力及与上游信号因子（如转录因子）之间的
