1、 年 月第 卷第 期成都中医药大学学报，.，.实验研究钩吻生物碱衍生物的设计、合成和抗结直肠癌活性研究谢欣，李想，黄维，韩波，彭成，（成都中医药大学，四川 成都；西南特色中药资源国家重点实验室，四川 成都）【摘 要】目的：围绕有毒中药钩吻生物碱抗肿瘤药效骨架，引入经典抗肿瘤药效基团，设计并合成新型钩吻生物碱衍生物，评价其对结直肠癌细胞株体内外抗肿瘤活性。方法：通过药效结构拼合的方法，以钩吻生物碱共同药效骨架 氧化吲哚螺环结构为出发点，引入抗肿瘤药效基团异噁唑片段，设计目标化合物；以含氧化吲哚骨架的 碳酸酯和 甲基硝基烯基异噁唑为原料，通过高度区域选择性，环加成反应，制得新型钩吻生物碱衍生物 含
2、有异噁唑基团的 螺环戊烯氧化吲哚；用 （）法测定新型钩吻生物碱衍生物对多种人结直肠癌肿瘤细胞株的增殖抑制作用；用人结直肠癌细胞 采用皮下注射法构建小鼠肿瘤模型，观察不同浓度钩吻生物碱衍生物的体内抗肿瘤作用。结果：得到产率为 的目标钩吻生物碱衍生物（），新化合物结构经，和 确证，为甲基氯（异丙基苯基）（甲基硝基异噁唑基）氧代螺 环戊烷，吲哚 烯羧酸酯；该新型钩吻生物碱衍生物能抑制、和 细胞增殖，其半数抑制浓度（）分别为.，.，.，.，.，.和.，其中对 的抑制作用较阳性对照药物阿霉素更好；钩吻生物碱衍生物高、中、低剂量组腹腔注射给药均能抑制 模型小鼠肿瘤生长，其体内抗肿瘤生物活性呈剂量依赖。结论
3、：该新型钩吻生物碱衍生物具有良好的抗结直肠癌活性，可作为抗肿瘤先导药物进行进一步研究，拓展创新中药途径。【关键词】钩吻生物碱；氧化吲哚螺环化合物；结直肠癌；中药创新药物；抗肿瘤【中图分类号】.；.【文献标识码】【文章编号】（）【编码】.【引文格式】谢欣，李想，黄维，等.钩吻生物碱衍生物的设计、合成和抗结直肠癌活性研究.成都中医药大学学报，（）：，.【开放科学（资源服务）标识码（）】【基金项目】国家自然科学基金项目（）；四川省应用基础研究基金项目（，）；成都中医药大学“杏林学者”人才提升计划【第一作者】谢欣，女，年生；博士，高级实验师，硕士生导师；：.【通信作者】韩波，男，年生；博士，研究员，博
4、士生导师；：.。彭成，男，年生；博士，研究员，博士生导师；：.结直肠癌（，）是常见的恶性肿瘤，发病率和死亡率较高。年到 年，在全球范围内，的新发病例数增加了一倍多。其中，中国是全球 发病数最高的国家。年 月国家癌症中心发布的最新统计数据显示，是我国第二大癌症，每年新发肠癌达.万人，发病率仅次于肺癌。目前，尚无针对 防治的有效手段。近年来，面对 发病率和病死率的快速增长，在 中医药发展战略规划纲要（年）的指导下，我国中医药工作者充分发挥中医药的特色和优势，在 的预防、治疗和抗转移复发中，已取得一定进展。然而，中药成分众多，除了少数单独应用可以直接作为药物使用外，多数成分因药效低、毒性高或药动学性
5、质不佳，无法单独成药。因此，以这类成分作为先导物，进行结构修饰及构效关系研究，最终开发成药效、药物动力学性质更优良的药物，已成为基于中药药效物质新药研发的一条成都中医药大学学报 年第 卷创新道路，对中药现代化也具有重要意义。钩吻（.）始载于 神农本草经，为马钱科胡蔓藤属植物，又名断肠草、胡蔓藤、大茶药等，具有祛风攻毒、散结消肿、止痛之功效。钩吻临床治疗恶性肿瘤疗效显著，其所含生物碱具有明确的抗 肿瘤细胞增殖作用，是发挥抗肿瘤活性的主要效应成分。然而，钩吻生物碱毒性强烈，限制了其临床应用，对其药效成分进行结构改造，有助于创新药物的发现。钩吻生物碱成分众多，均以氧化吲哚为主要骨架，钩吻吲哚生物碱的
6、结构复杂，多数主要成分在氧化吲哚骨架的 位具有螺环结构，如钩吻素甲（）、钩吻素子（）、钩吻绿碱（）等。氧化吲哚螺环骨架存在于具有多种活性的天然产物和合成药物中，如：天然螺环生物碱 、已进入临床前评价的合成小分子药物、正在进行临床前评估的 等，是一类重要的抗肿瘤活性结构单元。热休克蛋白 （，）在多种癌症中过度表达，被认为是促进 进展的致癌蛋白。课题组前期通过初步的分子对接，发现钩吻生物碱可能通过抑制 发挥抗肿瘤作用，其吲哚骨架结构能与 的 空腔较 好 吻 合，其 螺 环 结 构 与、和 口袋相结合（图）。我们推测钩吻生物碱可能通过结合 发挥抗肿瘤作用，但结合作用不强，因此活性有限，可通过引入经典
7、的抗肿瘤药效片段增加其抗肿瘤作用。异噁唑（）结构已被证实具有多种生物活性，尤其被用于引入小分子化合物增加抗肿瘤作用，已获得一些成功案例，如：、和，其中 是经典的 抑制剂之一。因此，在钩吻生物碱药效骨架基础上引入异噁唑基团，有可能通过药效团拼合的方法得到活性更好的抗肿瘤药物（图）。根据上述研究思路，本课题组前期以钩吻生物碱中的 氧化吲哚螺环作为药效骨架，简化复杂结构，引入经典抗肿瘤药效团异噁唑结构，设计并合成了 个创新结构的钩吻生物碱衍生物，并通过初步的细胞活性筛选出一个活性较好的先导化合物。本文进一步对该钩吻生物碱衍生物进行了体内外抗肿瘤活性研究。实验材料与设备.实验试剂叔丁基 （叔丁氧羰基）
8、氧 氯（甲氧基氧代丙烯基）氧代吲哚羧酸 叔丁酯（参考文献自制）、（）（异丙基苯乙烯基）甲基硝基异噁唑（参考文献自制）；吡啶二甲胺盐酸盐（批号：）、三氟乙酸（批 号：）、碳 酸 氢 钠（批 号：）均购自成都市科龙化工试剂厂。图 钩吻生物碱衍生物的设计思路 细胞培养基（批号：）、胎牛血清（批号：）、.胰蛋白酶（批号：）均购自美国 公司；磷酸盐缓冲溶液（批号：）、青霉素链霉素溶液（批号：）购自美国 公司；聚氧乙烯蓖麻油（批号：）、阿霉素（批号：）购自美国 公司；细胞增殖检测 试剂盒（批号：，北京博奥森生物技术有限公司）；实验用水为蒸馏水。.实验仪器 三用紫外线分析仪（上海嘉鹏科技有限公司）；恒温磁力
9、搅拌器（上海司乐仪器有限公司）；电子分析天平（上海乐平科技有限公司）；超纯水制造系统（上海优普有限公司）；旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；循环水式多用真空泵（日本 公司）；高分辨质谱仪（美国 公司）；核磁共振仪（美国 公司）；生物安全柜（青岛海尔有限公司）；高速冷冻离心机第 期谢欣 等 钩吻生物碱衍生物的设计、合成和抗结直肠癌活性研究（美国 公司）；光学倒置显微镜（日本 公司）；二氧化碳（）培养箱（美国 公司）；全自动酶标仪（美国 公司）.实验细胞及动物人 结 肠 癌 细 胞、和 购自中国科学院上海细胞库。级 裸鼠，雌雄各半，体质量 ，周龄，购自四川省中医药科学院实验动物中心，实验动物许可证
10、编号：（川）。实验方法.甲基氯（异丙基苯基）（甲基硝基异噁唑基）氧代螺 环戊烷，吲哚 烯羧酸酯（）的制备称取叔丁基 （叔丁氧羰基）氧 氯（甲氧基氧代丙烯基）氧代吲哚羧酸 叔丁酯（）.（）和（）（异丙基苯乙烯基）甲基硝基异噁唑（）.（.），放置于圆底烧瓶，加入含有吡啶二甲胺盐酸盐（，）的二氯甲烷 ，反应混合物在 下搅拌约 。，监测到原料 碳酸酯（）消失后，加入三氟乙酸（，溶于 二氯甲烷），并在室温下搅拌约 。监测至反应停止进展，停止搅拌，加入乙酸乙酯，用饱和的 水溶液萃取。取有机层，减压浓缩溶液，得淡黄色油状物。浓缩液在硅胶上进行快速色谱层析，洗脱剂为石油醚 乙酸乙酯 至，收集产物，减压蒸馏去除
11、洗脱剂，得到产物，真空干燥，称重计算收率，通过用核磁共振（和 ）和高分辨质谱进行产物结构鉴定和 值分析。制备路线见图。图 钩吻生物碱衍生物（）的合成方法.法检测钩吻生物碱衍生物（）对结肠癌肿瘤细胞增殖能力的影响观察肿瘤细胞，待生长到对数期时，收集细胞制成细胞悬液。将细胞悬液以 孔的密度接种到 孔板中，各孔溶液体积约 ，在，环境下使用 缓冲液培养。细胞贴壁后，各孔分别加入不同终浓度受试药物，每个浓度 个复孔，并设置空白组、溶剂组和阳性对照组。每孔各加入 溶液，在，环境下继续培养 。酶标仪 波长处测量每个孔的吸光度（）值，并通过 软件使用 回归法计算每个化合物的 值。.钩吻生物碱衍生物（）对结肠癌
12、 小鼠抑瘤作用的研究使用 周龄 裸鼠，雌雄各半，适应性喂养 后，将处于对数生长期的 细胞用生理盐水配置为 的细胞悬液，按照每只 .接种于小鼠皮下后肋部，构建结肠癌小鼠肿瘤模型。肿瘤细胞接种后约，淘汰肿瘤体积偏离平均值过多的小鼠，选取肿瘤体积为 的小鼠，随机分为 组（溶剂对照组和钩吻生物碱衍生物高、中、低剂量组），只 组。钩吻生物碱衍生物（）溶解于由聚乙烯蓖麻油、乙醇和 纯化水组成的溶剂中，高、中、低剂量组分别为 、，按.只进行腹腔注射给药；溶剂对照组注射等量溶剂。每隔 给药 次，连续 次。动物模型体质量和肿瘤体积测定：每隔 记录 次小鼠体质量和肿瘤体积。肿瘤体积通过测量肿瘤长径、肿瘤短径计算（
13、肿瘤体积 长径 短径.），绘制肿瘤生长曲线。于小鼠成瘤后 解剖小鼠，取肿瘤组织进行称重。计算不同浓度给药组的体内抑瘤率，抑瘤率（给药组对照组）。同时观察小鼠有无体质量明显降低、腹泻、皮疹、抽搐等反应。实验结果.目标钩吻生物碱衍生物（）的结构鉴定共得到白色固体粉末.，收率，氢谱测定 值，.。（，）（）.（，），.（，），.（，.，），.（，.，），.（，.，成都中医药大学学报 年第 卷.，），.（，.，），.（，.，），.（，.，.，），.（，.，），.（，），.（，.，.，），.（，），.（，.，），.（，.，）。（，）（）.，.，.，.，.，.，.，.，.，.，.，.，.，.，.，.，.，.
14、，.，.，.，.，.，.。（）：计算值：.，实测值：.。经核磁共振和高分辨质谱分析，上述产物为目标化合物。.钩吻生物碱衍生物（）对不同人结直肠癌肿瘤细胞的体外增殖影响实验结果表明，钩吻生物碱衍生物（）对人结 肠 癌 细 胞、和 肿瘤细胞株具有不同程度的抗增殖活性。其中，对 细胞增殖的抑制活性最好，为.，相较阳性药物阿霉素更好。实验结果见表。表 钩吻生物碱衍生物（）对多种人结直肠癌肿瘤细胞株的 值，细胞株名称（）钩吻生物碱衍生物（）阿霉素.钩吻生物碱衍生物（）对人结直肠癌小鼠肿瘤生长的影响通过构建小鼠人 细胞 移植模型，探讨钩吻生物碱衍生物（）对于体内肿瘤生长的影响，实验结果显示，钩吻生物碱衍生
15、物（）不同浓度组小鼠 肿瘤模型成瘤后的肿瘤生长速度均小于对照组：钩吻生物碱衍生物（）在、和 剂量下均对人 肿瘤细胞 产生体内生长抑制作用，且呈剂量依赖关系（图，表）；此外，钩吻生物碱衍生物（）不同浓度组在小鼠模型成瘤后 的肿瘤质量均明显低于对照组，且呈剂量依赖（图）。实验过程中，并未发现钩吻生物碱衍生物（）各组小鼠出现腹泻、皮疹、体重降低等生理不适或毒性反应，表明在、和 剂量下，受试钩吻生物碱衍生物（）没有明显毒性作用。图 不同浓度钩吻生物碱衍生物（）对人结直肠癌细胞移植小鼠的肿瘤体积影响（）图 不同浓度钩吻生物碱衍生物（）对人结直肠癌细胞移植小鼠的肿瘤质量影响（）讨论在目前世界销售最好的 种
16、药物产品中，有以上是天然产物或其母核来源于天然产物。中药是由几千年来中医科学理论和临床实践经验凝聚而成的宝贵财富，其药效物质较非药用天然产物的优势极为明显，除传统复方的优势应用以外，不乏临床疗效导向的单体成分开发为化学实体类新药的成功先例，如中药麻黄中的麻黄碱，青黛中的靛玉红和青蒿中的青蒿素等。基于中药药效物质的创新药物发现无疑是中药现代化的重要组成部分。然而，中药成分众多，除了少数单独应用可以直接作为药物使用外，多数成分因药效低、毒性高或药动学性质不佳，无法单独成药。因此，以这类成分作为先导物进行结构修饰，可提高苗头活性化合物的疗效、减少不良反应，实现不同药理活性的分离；改善苗头化合物的药物动力学性质；简化药物结构，提高人工合成可行性；第 期谢欣 等 钩吻生物碱衍生物的设计、合成和抗结直肠癌活性研究表 不同浓度钩吻生物碱衍生物（）对人结直肠癌细胞移植小鼠的体内抑瘤率，剂量（）抑瘤率第 天第 天第 天第 天第 天第 天第 天开发具有自主知识产权、且符合国际用药标准的中药新药。中药有效成分结构修饰的成功案例如，由青蒿素结构修饰后得到的蒿甲醚和蒿琥酯，由五味子丙素得到的双环醇，由石杉碱甲得
