1、第35卷 第6期2023年6月生命科学Chinese Bulletin of Life SciencesVol.35,No.6Jun.,2023文章编号：1004-0374(2023)06-0816-08DOI:10.13376/j.cbls/20230006 技术与应用 收稿日期：2023-01-07；修回日期：2023-02-08*通信作者：E-mail:化学蛋白质组学技术在药物靶标鉴定中的应用张美婷，丁明*(中国药科大学生命科学与技术学院，南京 210009)摘要：药物开发过程面临多重挑战，而靶标确证是其中的重要一环。如何运用多种研究方法发现和确认小分子药物的靶标是目前研究人员的主要工作
2、内容之一。化学蛋白质组学整合了细胞生物学、合成化学和生物质谱等多门学科，为药物的靶标筛选提供了新平台。本文对近年来发展的基于生物质谱的化学蛋白质组学药物靶标鉴定技术进行了总结，结合具体应用分析其优缺点，并对该类技术的发展和应用进行总结和展望。关键词：化学蛋白质组学；药物靶标鉴定；ABPP；DARTS；SPROX；CETSA中图分类号：Q503 文献标志码：AApplication of chemoproteomics in drug target identificationZHANG Mei-Ting,DING Ming*(School of Life Science and Technol
3、ogy,China Pharmaceutical University,Nanjing 210009,China)Abstract:The drug development process faces multiple challenges,and target validation is an important part.How to use a variety of research methods to discover and confirm the targets of small molecule drugs is one of the main tasks of researc
4、hers at present.Chemoproteomics is an integration of cell biology,synthetic chemistry and biomass spectroscopy,which provides a new platform for drug target screening.In this paper,we review the development of chemoproteomic drug target identification technology based on biomass spectrum in recent y
5、ears,analyze its advantages and disadvantages combined with specific applications.We also summarize and prospect the development and application of this technology.Key words:chemoproteomics;drug targets identification;ABPP;DARTS;SPROX;CETSA人类使用药物来预防和治疗疾病已经有数千年的历史，药物进入体内后作用于特定分子靶标，从而调节疾病表型以达到相应治疗效果。目
6、前上市的药物中有 95%以上的标靶分子为蛋白质，其中以受体蛋白、酶、离子通道蛋白、转运蛋白为主1。然而，当药物研发进入临床试验后，会有 90%的候选药物面临失败。其中，靶点验证不足、疗效缺乏以及由于脱靶等问题导致的毒副作用是失败的主要原因2。因此，在现代药物研发过程中，靶标的确证至关重要，这就需要在整体和动态网络水平上对药物靶点进行更加全面且深入的认知。传统的仅对单个蛋白质进行研究的模式已无法满足现代药物研究的需求，因此派生出了一系列新的学科和技术。蛋白质组学(proteomics)是以生物体内基因组表达的所有蛋白质以及这些蛋白质的存在方式为研究对象的一门科学。随着蛋白质组学技术的出现，与其相
7、关的各个科学领域(如疾病诊断、个性化医疗、人工智能等)近年来都在迅速发展，组学技术的优势日益明显。化学蛋白质组学(chemoproteomics)则是蛋白质组学的一个重要分支，该学科整合了细胞生物学、合成化学和生物质谱等多门学科，为药物的靶标鉴定及机制研究提供了良好的平台。张美婷，等：化学蛋白质组学技术在药物靶标鉴定中的应用第6期8171化学蛋白质组学概念化学蛋白质组学相较于蛋白质组学而言，通常在实验中涉及一种药物或潜在药物分子，这就是“化学蛋白质组学”一词的由来。它是一种以发现为驱动的蛋白质组学技术，通过表征化合物与蛋白质之间的相互作用来评估靶点结合、作用机制和(或)非特异性脱靶情况。该技术
8、通常适用于各个物种(动物、植物、微生物)的大多数类型的细胞及组织，甚至能够用于监测动物体内的靶标特异性、药物的转运和激活以及剂量依赖性的靶点结合情况，从而辅助确定临床有效剂量范围。得益于日益发展的高分辨质谱技术和生物信息学分析，化学蛋白质组学技术具有系统性、高通量、高精度等特点，因此被研究人员广泛地应用于药物的靶点识别。此外，由于许多疾病都与翻译后修饰或蛋白质-蛋白质相互作用的变化有关，而这两者在一定情况下都会对蛋白质活性或功能产生影响，化学蛋白质组学也越来越多地被用于评估疾病状态下蛋白质功能的差异，从而鉴定生物标志物，甚至是疾病治疗的潜在靶点3。2化学蛋白质组学研究方法及应用2.1基于活性的
9、蛋白质谱分析(activity-based protein profiling,ABPP)2.1.1ABPP技术简介ABPP 是化学蛋白质组学最成功的例子之一，最早由美国 Scripps 研究所 Cravatt 小组发明4-5。该技术通过将基于活性的小分子化学探针(activity-based probes,ABP；通常作用于酶的活性中心)与细胞或组织裂解液进行孵育，能够同时报告整个蛋白质组范围内结构和(或)功能相关的酶的状态，结合生物质谱及生物信息技术，可得到高精度的药物与细胞靶蛋白结合模型，是经典蛋白质组学与功能蛋白质组学间的重要过渡桥梁。ABPP 实验流程如图 1 所示。ABP 主要由两
10、部分组成：与蛋白质直接结合的反应基团(reactive group)和用于富集/分析的报告基团(reporter group)，两者通常通过聚乙二醇或碳链连接在一起。反应基团一般为亲电基团，可以与含有高活性亲核基团(丝氨酸、苏氨酸和半胱氨酸残基)的蛋白质形成共价复合物，从而“抓住”靶点。对于通过以非共价结合方式与靶蛋白进行相互作用的活性小分子，在设计探针时则需额外引入一个光交联基团(如双吖丙啶、二氮嗪和芳香叠氮化物)将两者间的相互作用转化为共价键。报告基团负责将反应基团“抓住”的靶点从蛋白质组中“钓”出来。报告基团主要有两大类：一类是荧光基团(荧光素、罗丹明和 Cy3/Cy5 等)，当被探针标
11、记的蛋白质组通过聚丙烯酰胺凝胶分离时，靶蛋白会发出荧光信号，便于检测和后续鉴定；另一类是生物素或炔基基团，用于特异性富集和分离靶蛋白。随着生物正交反应技术的发展，炔基基团正在被广泛应用6。该基团不仅可以极大地减小整个分子探针的空间位阻，也简化了探针的合成步骤。目前已有的ABP 主要分为两大类：(1)靶向特定蛋白质家族，如蛋白激酶、HDAC 家族、水解酶、P450 酶系、去泛素酶和磷酸酶等；(2)靶向蛋白质序列中的几种活泼氨基酸残基，如丝氨酸、赖氨酸、组氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和甲硫氨酸等。ABP 结构示意图如图 2 所示。ABPP 技术解决了传统靶标发现方法(如亲和色谱纯化)的一些弊端，过程简
12、单，无需对目标化合物进行固定化。但此方法需要配体的详细结构活图1 ABPP实验流程示意图生命科学第35卷818性信息，针对配体结构逐一设计探针。该过程不仅费力耗时，并且还可能改变药物本身的性质，而且有些小分子化合物无法进行化学修饰，因此该方法存在一定的局限性。2.1.2ABPP技术在药物靶标鉴定中的应用随着质谱及定量标记技术不断地发展，针对多种类型蛋白质家族的 ABP 的设计合成不断成熟，ABPP 已经被广泛应用于生命科学的诸多领域分支，成为新药研发过程中的重要工具。中医药是中华民族的瑰宝，在人类千百年来与疾病的斗争中发挥着重要作用。然而，天然产物一般具有多成分、多靶点和多功能等特点，通常情况
13、下无法确定其发挥药效的具体靶标蛋白，限制了进一步的临床应用。苏木酮对小胶质细胞的激活有明显的抑制作用，然而其具体的药理靶标尚未阐明。Liao 等7利用 ABPP技术分别合成报告基团为Biotin和Cy3的两种探针，结合稳定同位素标记技术(stable isotope labeling by amino acids in cell culture,SILAC)，鉴定出肌苷单磷酸脱氢酶 2(inosine monophosphate dehydrogenase 2,IMPDH2)的 Cys-140 为苏木酮的特异性结合靶点。作者通过进一步实验发现，苏木酮与 IMPDH2 的Cys-140 位点结合
14、后导致该酶发生变构，从而封闭IMPDH2 的催化口袋，导致其失活，进而有效抑制神经炎症反应。此外，许多天然产物中的著名成分如青蒿素8和黄芩苷9等也通过此技术鉴定出相应的靶蛋白。Lanning 等10通过 ABPP 结合定量质谱策略，对人类癌细胞中共价激酶抑制剂靶向的蛋白质组进行了全面深入的分析。研究发现，包括已批准的药物在内的共价激酶抑制剂都有明确但有限的浓度窗口以实现选择性抑制靶蛋白，一旦超出该范围就会出现脱靶效应以及与靶标激酶无关的细胞毒性。富马酸二甲酯(dimethyl fumarate,DMF)是一种治疗多发性硬化症的处方药，也可用于治疗银屑病。Zaro等11利用同位素标记串联正交水解
15、酶-活性蛋白表达谱(isotopic tandem orthogonal proteolysis-ABPP,isoTOP-ABPP)分析鉴定到白介素-1 受体相关激酶4(interleukin-1 receptor-associated kinase 4,IRAK4)的 Cys-13 是 DMF 的主要细胞靶点。作者进一步研究发现，DMF 以 Cys-13 依赖的方式阻断 IRAK4-MyD88之间的相互作用，从而抑制 IRAK4 介导的细胞因子产生及 IFN-通路，最终减缓自身免疫性疾病的发生。该研究成功揭示了 DMF 作为抑制自身免疫性疾病药物的分子机制，为更好地寻找该类疾病的靶点提供了数
16、据支持。Zhuang 等12设计合成了多种基于胆汁酸(bile acid,BA)结构的光交联探针并将其应用于稳定同位素氨基酸标记培养的活细胞中，共鉴定到 600 多种高可信度的 BA 相互作用蛋白。该研究数据为理解胆汁酸在人体生理和病理过程中的调节作用提供了宝贵的资源。光反应基团(photoreactive group)使 化 学 家 们 能 够 利 用 光 笼(photocage)激活生物学功能13，该类探针在活细胞图2 ABP结构示意图及示例张美婷，等：化学蛋白质组学技术在药物靶标鉴定中的应用第6期819超高分辨荧光成像14以及药物高时空分辨精准递送15-16中均有广泛应用。除了蛋白质，基于探针的化学蛋白质组学方法也可以用于分析各种生物大分子的相互作用，如脂质、DNA 和 RNA17。Cravatt 课题组报道了一组基于脂质的化学蛋白质组探针及其在哺乳动物细胞中的相互作用图谱18。每个探针在常见的脂肪酸基团(花生四烯酸、油酸、棕榈酸和硬脂酸)的基础上都加上了双吖丙啶光敏基团和炔基基团。该研究数据表明，脂质探针可富集和鉴定数百种脂质结合蛋白，通过对蛋白质位点具体分析，可确定影响脂质的
