1、 ，（）：张镇梁，王美娜，李健，等，管叶槽舌兰新鲜及硅胶干燥根样内生菌多样性研究 广西植物，（）：，（），（）：管叶槽舌兰新鲜及硅胶干燥根样内生菌多样性研究张镇梁，王美娜，李 健，李素珍，段晓娟，乔 琦（河南科技大学 农学院 牡丹学院，河南 洛阳；深圳市兰科植物保护研究中心 全国兰科植物种质资源保护中心，深圳市濒危兰科植物保护与利用重点实验室，兰科植物保护与利用国家林业和草原局重点实验室，广东 深圳 ）摘 要：管叶槽舌兰（）是一种珍稀濒危兰科植物，其野生种群亟需保护。内生菌对兰科植物的生长发育至关重要，为评估管叶槽舌兰内生菌的多样性、分析采样方式对其内生菌的影响，该文采用高通量测序技术对迁地保
2、育状态下新鲜与硅胶干燥的管叶槽舌兰根内生菌进行研究。结果表明：（）新鲜及干燥管叶槽舌兰根内生菌物种组成明显不同，管叶槽舌兰内生真菌注释到 门 科 属，内生细菌注释到 门 科 属；干燥后管叶槽舌兰根内生真菌注释到 门 科 属，内生细菌注释到 门 科 属。（）迁地保育状态的管叶槽舌兰根样内生菌具有丰富的多样性，并且内生细菌群落丰富度和多样性远比内生真菌群落高；经硅胶干燥后，内生真菌 多样性指数升高、多样性指数降低，而内生细菌的 多样性指数降低、多样性指数则升高。（）差 异 显 著 性 真 菌 黄 盖 小 脆 柄 菇（）和刺盘孢属（）的 只存在于新鲜根样中，新鲜管叶槽舌兰差异显著性细菌是马赛菌属（）
3、，干燥根样中差异显著性细菌类群包括拜叶林克氏菌科（）、黄色杆菌科（）及慢生根瘤菌属（）。（）共发生网络分析显示，经干燥后管叶槽舌兰根样内生菌群落中占互作主导地位的优势物种和互作模式都发生了改变。综上认为，不同采样处理会影响管叶槽舌兰根内生菌的群落结构，在研究兰科植物根样内生菌时宜使用新鲜的根样。该研究结果为管叶槽舌兰野生种群保护及人工栽培提供了内生菌数据基础，也为兰科植物内生微生物采样方法提供了参考。关键词：管叶槽舌兰，内生真菌，内生细菌，新鲜，硅胶干燥，多样性中图分类号：文献标识码：文章编号：（）（），收稿日期：基金项 目：国 家 自 然 科 学 基 金（）；深 圳 市 可 持 续 发 展
4、专 项（）；深 圳 市 科 技 计 划 项 目（）。第一作者：张镇梁（），硕士研究生，研究方向为植物保护，（）。通信作者：乔琦，博士，教授，研究方向为植物保护生物学，（）。（，；，）：，：（），（），（），（），：，生态系统中，植物与大量微生物相互作用，这些微生物在地下和地上植物器官的内部和外表面都有定殖（，；，），这些与植物相关的微生物群落统称为植物微生物群（，）。细菌和真菌是植物微生物群的主要组成部分，它们对植物微生态系统的平衡起到重要作用。植物中的内生菌是指其生活史的一定阶段或全部阶段，生活于健康植物中的各种组织和器官的细胞间隙或细胞内的菌类。内生真菌对兰科植物非常重要，兰科菌根真菌属于
5、内生真菌，它们是兰科植物生长发育各个阶段不可或缺的关键因素，能直接参与兰科植物根系甚至整个植株的生理代谢活动，从而保障兰科植物的生长、个体间竞争以及对病原体的防御（盖雪鸽等，；，）。高 越 等（）从 手 参（）根系中 分 离 出 角 担 菌 属（），将该菌株与手参种子进行共培养，发现它能明显促进手参种子原球茎的形成且最终分化成幼苗。杨文科（）通过迁地共生萌发从白旗兜兰（）原球茎中分离出胶膜菌属（），它能有效促进其种子萌发直到幼苗阶段。这都表明内生真菌在兰科植物的生长发育中具有极大的促进作用。据不完全统计，已报道的常见兰科植物菌根真菌有 属，分别隶属 于 担 子 菌 门（）、子 囊 菌 门（）及
6、毛霉门（）的 科（王美娜等，）。此外，兰科植物的内生菌中还存在大量有益的内生细菌，这些有益的内生细菌对兰科植物的生长发育 也 发 挥 着 积 极 的 促 进 作 用，等（）研究表明内生细菌能促进兰科植物种子萌发、光合形态建成、缓解非生物胁迫及生长发育等。广 西 植 物 卷目前，关于兰科植物根部细菌结构和功能的认知还非常有限（，）。从兰科植物中分离出的细菌通常属于变形菌门（）、放线菌门（）和厚壁菌门（），不同的内生细菌类群对兰科植物具有不同程度的促进作用，等（）研究发现，类芽孢杆菌属（）能促进 幼苗的生长。从兰属（）根中分离出的根瘤菌属（）能 溶 解 磷 酸 钙。此 外，等（）研究表明，兰科植物
7、菌根中存在菌根辅助细菌（），能与菌根真菌特异性结合，刺激菌根真菌的孢子萌发和菌丝生长，促进菌根真菌在宿主植物中定殖和生长，加强菌根化，从而促进植物生长及增强抗逆性（陈耀丽等，；，）。因此，加强兰科植物内生细菌的研究，在兰科植物的相关微生物研究中显得非常重要。管叶槽舌兰（）隶属于兰亚科（）万代兰族（）槽舌兰属（），分布在中国的云南以及缅甸、泰国，常附生在山地林中的树干上，海拔一般在 以上，具有较高的观赏价值，濒危等级为（濒危），其野生种群亟需保护。目前，对管叶槽舌兰的研究主要集中在系统发育、生物地理学和细胞学等方面，对其根部内生菌的研究鲜有报道。另外，等（）针对植物内生微生物的研究在采样时为方便
8、野外作业经常采用硅胶干燥的方法，这有可能会引起根内微生物群落的极大变化。因此，本研究采用 和 高通量测序技术的方法，对管叶槽舌兰新鲜及硅胶干燥根样中的内生真菌和内生细菌群落进行研究，拟探讨：（）管叶槽舌兰根样内生菌类群的多样性；（）管叶槽舌兰新鲜根样与干燥根样中内生菌群落的差异；（）管叶槽舌兰根样内生细菌和真菌的比较。本研究为管叶槽舌兰的种植及种质资源保护提供了内生真菌和细菌方面的数据，同时为研究兰科植物根内微生物提供采样处理的依据。材料与方法 样品采集和预处理在深圳市兰科植物保护研究中心，采集迁地保护状态下的管叶槽舌兰生长健康的根，在不影响管叶槽舌兰正常生长的情况下，每个样品取 条长 的根段
9、，尽量由 株以上的管叶槽舌兰根样组成，采集的同一组根样分别做新鲜及干燥根样的预处理。新鲜根样预处理在根段取材后即刻进行，步骤如下：用流水冲洗根表面后，用次氯酸钠和 酒精依次消毒 ，加入无菌水，洗净弃废液，将预处理后得到的最后一次无菌水进行 提取和风险建库测试，未得到任何结果表明样品得到了很好的预处理。将新鲜根样置于 冰箱以备提取微生物组。将干燥根样在预处理后放入硅胶中干燥 ，备用。每个处理重复 次。根内微生物组 提取、扩增、文库构建及 测序使用 试剂盒对根内微生物组 进行提取。内生真菌选择带 的特异引物（：和：），内生 细 菌 选 择 带 的 特 异 引 物（：和：）进行 扩增（，；，）。反应
10、程序：预变性；进入 个扩增循环 ，（真菌）、（细菌），；延伸 。反应体 系（）：（），（），补充 至 。使用 浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测，产物胶回收纯化后使用 建库试剂盒进行文库构建，利用 平台进行测序（北京诺禾致源生物科技有限公司）。数据分析测序数据截去 和引物序列后，使用（）进行拼接，得到 后使用 软件对 进行过滤得到高质量的 。参照（）的 质量控制流 程 和 去 除 嵌 合 体 处 理 后 得 到 有 效 数 据。利用 软件（）以的一致性对所有样品的全部 进行聚类得到，对出现频数最高的 代表序列 采 用 软 件（）中 的 和 方法与真菌数据库 和细菌数据库 期张镇梁等：管叶槽舌兰新鲜及
11、硅胶干燥根样内生菌多样性研究 进行物种注释分析，统计各样本的群落组成。以样本中数据量最少的为标准进行均一化处理后，基于 软件计算 多样性指数及 多样性指数，并进行 差异显著性检验。利用 软件的 包和 包进行维恩图及无度 量 多 维 标 定 法（，）分析。为进一步挖掘分组样本间的差异显著性真菌和细菌类群，选用、统计分析方法对分组样本的物种组成和群落结构进行差异显著性检验。对所有样品的相关性指数（斯皮尔曼相关系数）进行计算后，用 对相关系数的绝对值进行过滤，结合物种丰度构建共发生网络（）图。结果与分析基于 测序技术，从 个管叶槽舌兰根部 共获得 条有效，有效 范围为 。从管叶槽舌兰根部 共获得 条
12、有效，有效 范围为 。内生菌群落物种组成和采样处理对其影响注释结果发现，新鲜管叶槽舌兰注释到的根内生真菌有 门 科 属，其中子囊菌门相对丰度为，担子菌门相对丰度为，球囊菌门（）、罗兹菌门（）、被孢霉门（）、毛霉门相对丰度在 左右；而经硅胶干燥后的管叶槽舌兰注释到的根内生真菌有 门 科 属，其中子囊菌门相对丰度为，担子菌门相对丰度为，球囊菌门、被孢霉门、毛霉门、罗兹菌门的相对丰度在 以下。在 个分组中，子囊菌门都占绝对优势。相比较而言，干燥后管叶槽舌兰根样内生真菌类群数量变多；新鲜管叶槽舌兰根样内生真菌群落中子囊菌门、球囊菌门占比低于硅胶干燥根样中的内生真菌群落，而兰科菌根真菌最多的担子菌门明显
13、高于硅胶干燥根样中的内生真菌群落（图：）。经硅胶干燥后，管叶槽舌兰根内生真菌在科水平（图：）的相对丰度发生了改变，曲霉科（）在干燥后丰度明显降低，而枝孢霉科（）在干燥后丰度明显升高，小丛壳科（）和胶膜菌科（）的相对丰度在经硅胶干燥后的根样品中的丰度几乎为零。在属水平上（表，图：），管叶槽舌兰根内生真菌的相对丰度发生了改变，青霉属（）、瘤菌根菌属（）经干燥后的丰度降低，而枝孢属（）、镰刀菌属（）和 在干燥后丰度明显升高，小脆柄菇属（）和刺盘孢属（）的相对丰度经硅胶干燥后的丰度为零。从排名前 的硅胶干燥处理前后管叶槽舌兰根部内生真菌属水平绝对丰度值变化可以看出，青霉属、瘤菌根菌属、及亚隔孢壳属（）
14、在干燥后丰度值降低，其余属如、枝孢属、曲霉属（）、镰刀菌属、假裸囊菌属（）、红菇属（）和链格孢属（）等在干燥后丰度值增加，而小脆柄菇属和刺盘孢属在经硅胶干燥后的根部样品的丰度值为零。这与管叶槽舌兰根内生真菌在属水平的相对丰度变化趋势总体相似。根据 聚类结果（本文将未注释到的 包含在内一起计算，下同），绘制 韦恩图（图：），结果显示新鲜管叶槽舌兰根样中内生真菌特有的 有 个，主要是子囊菌门（个）和担子菌门（个）；而经硅胶干燥后根样中内生真菌有 个特有，主要隶属于子囊 菌 门（个），担 子 菌 门 仅 有 个；个分组共有的 仅有 个，其中有 个 属于子囊菌门，个 属于担子菌门。这表明干燥后的管叶槽
15、舌兰根样中内生真菌群落在丧失掉新鲜根样中的一些真菌类群的同时，也产生了相当数量的新的真菌类群，这些新产生的真菌主要隶属于子囊菌门。在内生细菌方面，新鲜管叶槽舌兰根内生细菌注释到 门 科 属，其中变形菌门相对丰度为 ，蓝 藻 门（）相 对 丰 度 为，厚壁菌门相对丰度为 ，放线菌门（）相 对 丰 度 为 ，拟 杆 菌 门（）、螺旋体门（）、酸杆菌门（）、绿弯菌门（）的相对丰度低于；而经硅胶干燥后的管叶槽舌兰注释到的根内生细菌有 门 科 属，其中变形菌门相对丰度为，厚壁菌门（）相对丰度为，放线菌门相对丰度为，拟杆菌门（）相对丰度为，蓝藻门相对丰度为 ，螺旋体门、酸杆菌门、硝化螺旋菌门（）、绿弯菌门
16、的相对丰度低于（图：广 西 植 物 卷）。在 个分组中变形菌门丰度均占绝对优势。相比较而言，干燥后管叶槽舌兰根样内生细菌类群数量同样变多，经硅胶干燥后，占主要优势的变形菌门、厚壁菌门、放线菌门细菌相对丰度均有明显提高（图：）。管叶槽舌兰根内生细菌经硅胶干燥后在科水平（图：）的相对丰度发生了改变，鞘脂单胞菌科（）、拜叶林克氏菌科（）、肠杆菌科（）、红 杆 菌 科（）、黄 色 杆 菌 科（）、假单胞菌科（）、瘤胃菌科（）、根瘤菌科（）等占比均明显升高，而伯克氏菌科（）在干燥后明显降低。在属水平上（表，图：），管叶槽舌兰根内生细菌的相对丰度发生了改变，鞘氨醇菌属（）、假 单 胞 菌 属（）、肠 杆 菌 属（）、慢生根瘤菌属（）、副球菌属（）和泛菌属（）在干燥后丰度明显升高，而马赛菌属（）在干燥后明显降低。从排名前 的硅胶干燥处理前后管叶槽舌兰根内生细菌属水平绝对丰度值变化表中可以看出马赛菌属和 在干燥后丰度值降低，其余属如鞘氨醇菌属、假单胞菌属、肠杆菌属、泛菌属和分支杆菌属（）等经干燥后丰度值都明显增加，这与管叶槽舌兰根内生细菌在属水平的相对丰度变化趋势相似。根据 聚类结果，绘制 韦恩图（图
