1、研究报告生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN2023,39(6):274-285收稿日期：2022-10-08基金项目：国家自然科学基金项目（32160375），贵州省科技计划项目（黔科合基础2022一般 210）作者简介：徐红云，女，博士，讲师，研究方向：资源微生物、林木抗逆育种；E-mail:通讯作者：于存，博士，副教授，硕士生导师，研究方向：林业资源微生物开发与利用；E-mail:根际溶磷伯克霍尔德菌 Paraburkholderia spp.对马尾松苗的促生作用徐红云1 吕俊2 于存2（1.贵州民族大学生态环境工程学院，贵阳 550025；2.贵州大学林学院，贵阳
2、550025）摘 要：为筛选溶磷效果较好的根际细菌（phosphate-solubilizing rhizobacteria,PSB），并明确其对马尾松苗的促生效果和作用机制。利用土壤稀释平板法进行 PSB 菌株的分离和纯化，通过形态学和 16S rDNA 分子测序等方法进行 PSB 菌株的鉴定，最后将PSB 菌株接种至马尾松苗，培养 60 d 后测定马尾松苗生长、生理、苗根际土壤理化性质和根际细菌群落结构和组成。结果表明：由马尾松根际土中分离获得溶磷能力较强的 3 个 PSB 菌株 WJ10、WJ25 和 WJ41 均为伯克霍尔德菌 Paraburkholderia spp.；3 个 PSB
3、菌株对磷酸铝的增溶能力最强，其次是磷酸三钙、磷酸氢钙和磷酸铁；盆栽试验表明，3 个 PSB 菌株均可促进幼苗的生长，其中WJ25 对苗高、根长的促进效果最明显，WJ41 和 WJ10 次之。3 个 PSB 菌株对苗促生的主要机制包括，PSB 提高了马尾松苗的根系活力、叶绿素 b、可溶性蛋白等生长指标及氮、磷和钾等养分含量；同时，提升了根际土有效磷、速效钾、活性氮、土壤养分含量、土壤酶活性；此外，3 个 PSB 菌株的添加还影响了马尾松苗根际细菌群落的组成和多样性，促进了 Bacillus、Nitrosospira、Gemmata和 Cytophaga 等有益菌在根际土壤中的显著富集。综上，本研
4、究筛选获得的 3 个溶磷伯克霍尔德菌，它们能够通过调控植物生理及改变根际微环境从而促进马尾松苗的生长。通过本研究，为马尾松根际溶磷细菌菌肥的开发和应用提供了理论依据。关键词：根际溶磷细菌；促生；伯克霍尔德菌；马尾松；根际微生物DOI:10.13560/ki.biotech.bull.1985.2022-1226Growth Promoting of Pinus massoniana Seedlings Regulated by Rhizosphere Phosphate-solubilizing Paraburkholderia spp.XU Hong-Yun1 LV Jun2 YU Cun2
5、（1.College of Eco-Environment Engineering,Guizhou Minzu University,Guiyang 550025;2.College of Forestry,Guizhou University,Guiyang 550025）Abstract:It is aimed to screen phosphate-solubilizing rhizobacteria（PSB）and to clarify its growth-promoting effect on Pinus massoniana seedlings and the mechanism
6、.The soil-dilution plate method was used to isolate and purify the PSB strains.The PSB strains were identified by morphology and 16s rDNA sequencing methods.Finally,the masson pine seedlings were inoculated with PSB strains for 60 d,then the seedling growth and physiological indexes,soil physical an
7、d chemical properties,and rhizosphere bacterial community were determined.The results showed that three PSB strains（WJ10,WJ25 and WJ41）with strong phosphate-solubilizing abilities were isolated from the P.massoniana rhizosphere soil and belonged to Paraburkholderia spp.The three PSB strains had the
8、strongest phosphate-solubilizing abilities to aluminum phosphate,followed by tricalcium phosphate,calcium monophosphate and ferric phosphate.Based on the pot experiment,the three PSB strains effectively promoted seedlings growth,with the best effects on the seedling height and root length promotion
9、for WJ25,followed by WJ41 and WJ10.The main mechanisms of seedling promotion of the three PSB strains include:1）The PSB strains increased the root activity,chlorophyll b,soluble protein,nitrogen,phosphorus and potassium contents in masson pine seedlings;2）meanwhile,PSBs enhanced 2023,39(6)275徐红云等：根际
10、溶磷伯克霍尔德菌 Paraburkholderia spp.对马尾松苗的促生作用磷是植物生长发育过程中的基本营养素，尤其是在幼苗生长的早期阶段1。尽管土壤中含有足够的磷，但植物只能获得极少量的磷，因为大多数土壤磷通过与钙（Ca2+）、铝（Al3+）和铁（Fe3+）等金属离子结合而转化为难溶的形式2-4。在中国，约有 95%土壤中的磷是难降解的磷形态，这大大限制了植物的健康发展5。克服这个问题的通常做法是使用化学磷肥。然而，频繁地投入化肥，投入成本增高的同时，也会恶化土壤健康，例如土壤压实、侵蚀、退化、生物多样性丧失和土壤微生物活性下降6。此外，由于磷肥是一种不可再生资源，如何有效减少目前磷肥的
11、浪费，回收土壤中的磷资源也非常重要。溶磷细菌（PSB）可以通过酸化、螯合、交换反应和产生有机酸等将不溶性磷酸盐转化为植物可用磷的形式7-8。此外，它们还可以促进植物有益微生物群落的生长，提高土壤微生物活性9。使用 PSB 提高土壤磷可用性不仅可以减少化学肥料的用量，而且还可以减少因过量施用磷肥而造成的环境污染10。迄今为止，已经报道了许多 PSB 菌株，包括重要的属：气球菌属 Aerococcus、农杆菌属Agrobacterium、节杆菌属 Arthrobacter、芽孢杆菌属Bacillus、Delftia 属、肠杆菌属 Enterobacter、欧文氏菌属 Erwinia、黄杆菌属 Fl
12、avobacterium、克雷伯菌属 Klebsiella、微球菌属 Micrococcus、伯克霍尔德菌属 Paraburkholderia、假单胞菌属 Pseudomonas、根瘤菌属 Rhizobium 和黄杆菌属 Xanthobacter 等4-5,11。然而，大多数 PSB 都是由农作物的根际分离出来的，相比之下，由木本植物的根际土壤中分离 PSB 和应用的报告较少5。马尾松（Pinus massoniana Lamb.）是中国南方造林的重要用材树种之一12-13。仅以贵州省为例，该省的马尾松栽植面积占全省 287 万 hm2松林面积的 1/4-1/3。贵州是典型喀斯特地区，该省的土
13、壤缺磷是一直以来阻碍马尾松人工林健康生长的重要因素14。虽然以往有较多报道利用菌根菌改良土壤磷进而促进马尾松生长的报道，但大部分菌根菌存在生长缓慢和易受环境因素影响的特点15。因此，在自然界中挖掘生长速度快且受环境因素干扰小的PSB 菌株，对解决磷限制马尾松生长发育具有重要意义。本研究在贵州省的健康马尾松根际土壤中分离和筛选高效 PSB 菌株；评价 PSB 对不同难溶性磷酸盐的溶磷能力；测试 PSB 菌株对马尾松苗生长、生理、土壤理化性质、根际微生物群落变化的影响，进而初步揭示 PSB 菌株对马尾松苗促生的作用机制。通过本研究为马尾松根际溶磷微生物肥料的开发和应用提供理论依据。1 材料与方法1
14、.1 材料1.1.1 供试土壤样品 土壤样品采集于贵州省贵阳市 20 年生的健康马尾松的根际，采集马尾松根系（直径小于 0.5 cm）后，轻轻摇动去除根上松散黏附的土壤，将根 4 mm 内紧密黏附的土壤（视为根际土壤）置于无菌塑料袋中，用于分离 PSB 菌株。1.1.2 供试种子 试验所用马尾松种子购买自贵州省都匀市马尾松林木良种基地。1.1.3 培养基 Pikovskaya（PVK）培养基：C6H12O6，10 g；Ca3(PO4)2，10 g，NaCl，0.3 g；KCl，0.3 g；MgSO47H2O，0.03 g；(NH4)2SO4，0.5 g；Mn-SO44H2O，0.03 g；Fe
15、SO47H2O，2.03 g；琼脂，20 g；蒸馏水，1 000 mL；pH 值，7.0；LB 琼脂培养基：胰蛋白酶，10 g；酵母提取物，5 g；NaCl，10 g，琼脂，20 g；蒸馏水，1 000 mL；pH 为 7.0。4 种不同磷源培养基：以 Ca3(PO4)2作为磷源的PVK 液体培养基；将 PVK 液体培养基中的 Ca3(PO4)2分别替换为 11.03 g/L 的 CaHPO42H2O、12.03 g/Lthe contents of available phosphorus,available potassium,active nitrogen,soil urease and
16、 phosphatase in rhizosphere soil;3）in addition,the addition of three PSB strains also affected the composition and diversity of the rhizosphere bacterial community,and promoted the significant enrichment of beneficial bacteria such as Bacillus,Nitrosospira,Gemmata and Cytophaga in the rhizosphere soil.In conclusion,the three Paraburkholderia spp.strains could promote masson pine seedlings growth by regulating plant physiology and changing rhizosphere micro-environment.This study provides a theor
