1、 ，（）：苏桂军，李霞，陈芋西，等，花生铝响应类受体蛋白激酶 的原核表达分析 广西植物，（）：，（），（）：花生铝响应类受体蛋白激酶 的原核表达分析苏桂军，李 霞，陈芋西，詹 洁，王爱勤，何龙飞，肖 冬，（广西大学 农学院 植物科学国家级实验教学示范中心，南宁；广西农业环境与农产品安全重点实验室，南宁；广西高校作物栽培学与耕作学重点实验室，南宁 ）摘 要：花粉类受体蛋白激酶（，）是一类富含 结构域的类受体蛋白激酶，不仅在花粉发育和植物受精中发挥作用，也在胁迫响应中发挥作用。基于对前期花生根尖铝胁迫转录组数据的分析，我们发现了在转录水平响应铝胁迫的花粉类受体蛋白激酶基因，为探究 在花生铝胁迫中的
2、功能，该文进一步分析了铝胁迫处理下 在花生耐铝品种和铝敏感品种中花 号（）根尖中的转录变化，通过序列分析、进化树构建等分析了 蛋白的结构特点和亲缘关系，克隆了 的胞内域序列（），并通过原核表达和体外磷酸化体系分析了 的自磷酸化活性。结果表明：（）不同铝处理时间及不同铝浓度处理后，的转录水平上调，显著响应铝处理，是铝诱导基因；（）含有 个氨基酸，属于 蛋白激酶家族成员，具跨膜域和信号肽，且预测具有磷酸化活性位点；（）体外诱导表达出约 的可溶性蛋白（），经凝胶亲和层析纯化，得到基于蛋白印迹实验（）验证正确的重组蛋白，重组蛋白可发生磷酸化修饰，但无明显的自磷酸化现象。综上认为，是一个铝胁迫应答基因，
3、参与花生铝胁迫早期应答机制，且能发生磷酸化修饰。关键词：花生，铝胁迫，花粉类受体蛋白激酶，表达分析，原核表达中图分类号：文献标识码：文章编号：（）（），收稿日期：基金项目：国家自然科学基金（）。第一作者：苏桂军（），硕士研究生，研究方向为作物生理，（）。通信作者：肖冬，博士，副教授，研究方向为作物生理与分子生物学，（）。（，；，；，）：（），（）（），：（），（），（），：（），花生（）是我国重要的油料和经济作物，是主要的食用植物油来源。在我国，花生产区可分为南方产区和北方产区。但是南方地区的土壤多为酸性土壤，值在 之间，含 量 高，交 换 性 占 阳 离 子 交 换 量 的（李庆逵，）。当
4、低于 时，铝以有毒的形态存在来引起作物毒害，故酸雨和铝毒被认为是南方地区农作物生长重要的限制因子之一（李学垣等，）。在我国，南方产区花生产量低于全国平均水平，与北方产区相比仍然存在较大的差距（鲁清等，），故通过阐明花生受铝毒害的机制，进而选育耐铝性品种来提高南方花生生产力愈发重要。研究表明花生受铝毒害的部位主要是根尖，表现为根系生长受抑制、线粒体功能受损、迸发以及发生细胞程序性死亡等（詹洁等，；徐芬芬等，；，）。花生响应铝毒害的机制主要包括外部排斥和内部耐受两种，这两种机制中需要众多成员参与来传递信号，发挥功能，最终使得花生响应铝毒害。类受体蛋白激酶（，）是一种由胞外域接收信号，后通过激酶域传
5、递和激活下游信号通路完成胞内外信号转导的酶活性受体（马媛媛等，），在植物中广泛存在，并可分为多个家族（，），参与众多生长代谢过程的调控，如参与植物的生长发育进程（，）、植物对病虫害防御应答（，）和植物抵抗非生物胁迫（，）等。蛋白是一类富含亮氨酸重复序列（）的 蛋白（，），首个 激酶是在矮牵牛中被发现，命名为，特异性分布在花粉中，并在减数分裂中发挥作用（，）。拟南芥中的 个 成员也在花粉中高表达，并命名为（，）。研究发现，在花粉管发育（，；，）、信号转导（，）和细胞死亡（，）等方面发挥了重要的调控作用，但关于 在胁迫中的功能研究很少，仅在拟南芥的低水势胁迫下研究发现，相较于野生型，突变体 会积累
6、更多的脯氨酸来响应胁迫（，），而 在铝胁迫下是否有响应还未见报道。期苏桂军等：花生铝响应类受体蛋白激酶 的原核表达分析 通过磷酸化作用传递信号进而响应胁迫。在冷胁迫下，激酶（）活性被激活，通过磷酸化（）来增加该转录因子的蛋白稳定性和转录活性，进而增强拟南芥对低温的抵抗能力（，）。（）与（）的 端存在相互作用，并且可磷酸化 来刺激 产生，进而影响 在植物胁迫应答中的调控（，）。（）激酶依赖于其蛋白浓度发生自磷酸化，其第 位的苏氨酸以及 环结构对磷酸化至关重要，并影响 对烟草细胞死亡的调控（，）。拟 南 芥 （）可响应拟南芥 信号路径参与免疫反应和生长发育调控，研究发现 具自磷酸化活性，并随着 浓
7、度增加而活性增强，其中第 位丝氨酸是关键活性位点，尽管该位点突变不会影响 调控营养生长和生殖生长时期的转换，却会对 引发的氧化应激表现高敏性状，同时对丁香假单胞菌具有更强的抵抗力（，）。这表明 的磷酸化活性与这些蛋白在植物胁迫应答中的作用密切相关。通过对实验室已有转录组数据的挖掘（，），我们发现花粉类受体蛋白激酶基因 转录受铝胁迫处理的诱导，并且在不同花生铝耐性品种中有着不同的响应模式，暗示其参与花生铝胁迫响应过程。本研究以 的铝胁迫响应模式和蛋白活性为研究内容，采用 检 测 了 不 同 铝 浓 度 和 处 理 时 间 条 件 下，在花生耐铝品种和铝敏感品种中花 号（）的转录变化，对 胞内域进
8、行克隆，并开展了原核表达分析，通过磷酸化抗体对其自磷酸化活性进行检测，拟探讨以下问题：（）的铝响应模式；（）胞内域的磷酸化状态。为后续在蛋白质水平上探究 蛋白的生化功能以及在铝胁迫下的作用机制奠定基础。材料与方法 材料供试花生品种由中国农业科学院油料作物研究所提供，并经实验室早期筛选鉴定出的铝敏感品种中花 号（）和耐铝品种（詹洁等，）。将花生种子经湿润珍珠岩催芽 后，去除花生种皮并掐除约 的主根根尖，在 条件下将材料置于改良的 营养液中培养至第三片真叶长出，转移花生幼苗至 溶液（）中培养 ，之后做以下两种处理：一是用 溶液（含，）分别处理花生幼苗、；二是用不同浓度的 溶液（、）分别处理花生幼苗
9、 和 。以上两种处理均以改良的 营养液处理作为对照，取约 的根尖作为实验材料。提取先参照植物总 提取试剂盒（）方法提取，之后参照反转录试剂盒（）方法进行 反转录，获得。在铝胁迫下表达量检测根据 基因（）序列设计荧光定量 检测引物（表），参 照 酶（）说明，设置 反应体系和程序，以 为内参，采用法进行基因相对表达量的分析。表 引物序列 引物名称引物序列（）（）用途荧光定量原核表达（下划线表示酶切位点）（）生物信息学分析利用在线网站 预测 的分子量、等电点等理化性质（：）；通过 来预测其亚细胞定位（：）；通过 比对获得其他物种对应的基因序列，利用 构建进化树，并在软件 进行多序列比对，同时通过广
10、西 植 物 卷 预测 蛋白的保守结构域（：）。对于目的蛋白的跨膜域以及信号肽分析分别通过在线网站 （：）和 （：）完成，同时对 的磷酸化位点以及互作蛋白进行了预测，磷酸化预测软件为 ，互作蛋白预测网站为（：？）。启 动 子 元 件 预 测 于 在 线 网 站 进 行（：）。激酶域克隆和原核表达载体构建从 上搜索得到 的基因序列，运用软件 设计激酶域克隆引物（表）。以 根 尖 为 模 板，克 隆 获 得 的 胞 内 激 酶 域，参 照 试剂盒方法连接 至 载体（双酶切位点为 和），热激转化至，将经过测序验证正确的阳性克隆菌株提取质粒（）。蛋白的原核表达和纯化将 重组质粒转化 至 感受态细胞，培养
11、至，加入终浓度为 的异丙基硫代半乳糖苷（），在 下诱导 蛋白表达，经 电泳检测蛋白的表达情况。参考 填料（公司）说明纯化 重组蛋白，并进行 验证。自磷酸化检测加 的 蛋白到 磷酸缓冲液（含 ，蛋白酶抑制剂和 ）中，以不加 为对照组，混合液于 下孵育 ，并于 下孵育 变性，后取 样品经 分离，并转膜依次用兔抗的酪氨酸磷酸化抗体（公司）、苏氨酸磷酸化抗体（公司）以及鼠抗的 抗体（康为世纪公司）孵育并化学显色，根据对照组和处理组条带差异判断磷酸化及激酶活性。结果与分析 在不同铝处理时间、浓度下的表达由图：可知，和经铝处理不同时间后，与对照相比，的表达量均上升，但两个花生品种中 的表达趋势有所差异，中
12、，在 的表达量最高，的表达量最低，随后表达量则一直增加。中，表达量则先增加后降低，在 达到最高。由图：，可知，在经不同铝浓度处理 和 后，发现在两个花生品种中 的表达量随着处理浓度的增加同样呈先增加后降低的趋势；且在不同铝浓度处理 时，在耐铝性品种中的响应比敏感性品种 更剧烈。综上所述，这些结果表明 是铝胁迫响应基因。的生物信息学分析 蛋白理化性质、结构特征及亲缘关系的分析分析（）的序列信息可知，该基因（）全长为 ，编码 个氨基酸。经预测该蛋白质分子量为 ，理论等电点为；蛋白 端具多个亮氨酸重复结构域，端具丝氨酸苏氨酸特异性蛋白激酶结构域，激酶域含有 结合位点，并与其他物种 成员的激酶域具较高
13、的同源性（图）；蛋白含有两个跨膜域，属于膜功能蛋白。因此，蛋白属于具有跨膜域和信号肽的丝氨酸 苏氨酸蛋白激酶。进化树构建结果显示 独立成一个分支，与比对的 个物种之间有较大的差异；拟南芥中，与 和 有较高的同源性（图）。进一步查询花生 家族分类，属于 蛋白激酶家族（，）。经预测 具可磷酸化的氨基酸位点，包括丝氨酸（）和苏氨酸（）。因此，可能与 和 具相近的功能，可能发生磷酸化。启动子分析和互作蛋白预测经花生基因组序列提取，得到 基因 前长 的启动子序列。分析启动子元件，结果表明：的启动子元件包括生长素响应元件、响应元件、响应元件等激素响应元件，期苏桂军等：花生铝响应类受体蛋白激酶 的原核表达分
14、析 不同铝处理时间；不同浓度铝处理 ；不同浓度铝处理 。不同小写字母代表 水平上存在差异。；图 在铝处理下的表达分析 光调控元件，干旱胁迫响应元件和 蛋白结合位点（图：）。以拟南芥数据库为筛选基础，筛选 的相互作用蛋白，发现 可与多个蛋白存在互作，包括（）、（）、（）、激酶（）、（）、（）、（）、（）、（）（图：），推测 可能参与激素调控、细胞死亡、非生物胁迫应答、生物防御、细胞壁膨大等调控过程。激酶域克隆和原核表达载体构建以根尖 为模板，克隆到 胞内域片段（）（图：），序列长度为 ，与目的片段（）序列同源。连接 片段和 载体，获 得 重 组 质 粒（）（图：）。重组蛋白诱导表达和纯化将含有
15、重组质粒的 菌株在 、环境中培养，在约 处发现诱导后的上清液中有加深的特异性条带，表明其以可溶性的形式存在于上清液中（图）。重组蛋白用 填料纯化，在结合后用 洗脱无明显条带（图：），表明层析柱与 重 组 蛋 白 结 合 较 好，后 经 洗脱后获得了条带单一且位置正确的目的条带，表明 重组蛋白已成功纯化。将获得的 纯化蛋白根据携带的标签蛋白经特异性 一抗孵育，进行 验证，可以发现在约 处出现清晰的特异性目的条带（图：），表明 重组蛋白纯化效果较好。重组蛋白体外磷酸化检测将纯化的 蛋白进行体外磷酸化实验，用磷酸化抗体检测磷酸化水平，用 抗体标定上样水平。由图 可知，两个磷酸化抗体孵育后，均能在目标
16、蛋白位置处检测到条带，磷酸化苏氨酸抗体（）有着更强的磷酸化信号，磷酸化酪氨酸抗体（）信号较弱，表明该蛋白在原核诱导的过程中已经发生了磷酸化修饰。但与对照组相比，处理并未使得条带有加深的现象（图），暗示 蛋白不存在体外自磷酸化活性。广 西 植 物 卷红线表示跨膜域；紫框表示 结构域；红三角表示 结合位点 活性位点；五角星表示活性位点；黑线表示激酶域。花生；拟南芥；非洲相思子；蒺藜苜蓿；豇豆；大豆；小果咖啡；茶。蛋白序列号依次为、。下同。；：，图 花生与其他物种 氨基酸序列比对 期苏桂军等：花生铝响应类受体蛋白激酶 的原核表达分析图 进化树分析 讨论与结论目前对 家族在胁迫应答机理的研究还未见系统的报道，仅在拟南芥突变体 缺水处理下发现，相较野生型来说，该突变体会积累 倍的脯 氨 酸 来 响 应 低 水 量 胁 迫（，）。前人研究也表明随着铝处理浓度的增加和铝处理时间的延长，花生根系游离脯氨酸的含量整体呈递增的趋势（徐芬芬等，）。本研究在对铝处理下花生根尖 转录水平的检测图 启动子元件分析及互作蛋白分析 ：；扩增产物。：；，质粒样品编号。：；：；，图 扩增 片段及重组质粒电泳检测 广 西
