1、Modern Practical Medicine,May 2023,Vol.35,No.5 586 集落刺激因子 1 在子宫内膜癌细胞中的表达及其意义金纬纬，林一禾，庄晓苹，赵小迎【摘要】目的探讨集落刺激因子 1（CSF1）在子宫内膜癌细胞系中的表达，为靶向治疗子宫内膜癌提供新的治疗思路。方法采用实时荧光定量聚合酶链式反应法、免疫印迹方法检测 CSF1 在子宫内膜癌 Ishikawa 细胞系中的表达情况，以高表达 CSF1 的 Ishikawa 细胞作为研究对象，利用特异性靶向 CSF1 基因的 shRNA 慢病毒敲除系统包装病毒，并感染 Ishikawa 细胞，使用流式细胞分选技术获得 C
2、SF1 稳定敲除细胞株，并分别在 mRNA、蛋白水平检测shRNA敲除效率，同时监测CSF1 敲除后不同时间点细胞增殖及凋亡水平。结果CSF1 在子宫内膜癌Ishikawa细胞中高表达，利用shRNA慢病毒敲除系统，抑制CSF1 在Ishikawa细胞中的表达可通过上调凋亡促进因子BAX，导致细胞增殖明显减缓，并诱导细胞凋亡（均 0.05）。结论CSF1 在子宫内膜癌细胞系中高表达，抑制 CSF1的表达可引起细胞大量凋亡，揭示 CSF1 可能对子宫内膜癌发生及发展具有正向调控作用。【关键词】子宫内膜癌；集落刺激因子 1；增殖；凋亡doi:10.3969/j.issn.1671-0800.202
3、3.05.007【中图分类号】R737.33【文献标志码】A【文章编号】1671-0800(2023)05-0586-04The expression and its regulatory mechanism of colony stimulating factor-1 in endometrial carcinoma cells【Abstract】ObjectiveTo explore the expression,function and related mechanisms of colony stimulating factor 1(CSF1)in human endometrial
4、cancer cell line and to provide a newstrategy for targeted therapy of endometrial cancer.MethodsReal-time quantitative PCR and Western blot were used to detect the expression of CSF1 in ISHIKAWA cells.UsingIshikawa cells with high expression of CSF1 as the research object,a shRNA lentivirus knockout
5、 system specifically tar-geting the CSF1 gene was used to package the virus and infect Ishikawa cells,and stable knockdown cell lines of CSF1were obtained by flow cytometry.The knockdown efficiency in the mRNA level and protein level were detected,while cellproliferation and apoptosis levels were mo
6、nitored at different time points after CSF1 knockout.ResultsReal-Time PCRand Western blot results showed that CSF1 was highly expressed in ISHIKAWA cells.Using shRNAlentivirus knockdownsystem could significantly knockdown the expression of CSF1viaupregulatingthepro-apoptotic factor BAX,whichcouldinh
7、ibitcellproliferationdramaticallyandinducecellapoptosis(all 0.05).ConclusionsCSF1canbehighlyexpressedin endometrial cell lines.Suppressed CSF1 expression can significantly induce cell apoptosis,which uncovered that CSF1may have a positive effect on the occurrence and development of endometrial cance
8、r.【Key words】Endometrial carcinoma;Colony stimulating factor 1;Proliferation;Apoptosis有研究显示肿瘤干细胞（CSCs）在子宫内膜癌的发生、发展、复发和耐药性等方面具有至关重要的作用1-4。但是如何精确识别、追踪及靶向杀伤 CSC是临床治疗子宫内膜癌的关键。集落刺激因子 1（CSF1）是机体内微环境中如肿瘤微环境和骨髓微环境常见的造血生长因子，其在血液系统中参与了多种免疫反应过程，可刺激造血祖细胞生长与分化，而在肿瘤微环境中，过往的研究显示 CSF1 在肿瘤细胞的侵袭迁移、免疫逃逸、脂质代谢、血管发生和炎症反应
9、中发挥重要作用5-8。有研究显示，CSF1 也表达于各类实体肿瘤细胞中，尤其在 CSCs 中呈现基金项目：浙江省医药卫生科技计划项目（2020KY923）；温州市基础性医疗卫生科技项目（Y20210354）作者单位：325001 浙江省温州，温州市中西医结合医院通信作者：赵小迎，Email：现代实用医学2023 年 5 月 第 35 卷 第 5 期 587 高表达9，但CSF1 在子宫内膜癌中的相关研究报道较少。本研究探讨 CSF1 在子宫内膜癌细胞中的表达情况，揭示其在子宫内膜癌发生发展中的作用，现报道如下。1资料与方法1.1主要试剂及仪器RPMI-1640 培养基（Gibco公司）；胎牛血
10、清（Excell 公司），TRizol（Invitrogen）；Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒（eBios-cience 公司），SYBRGreenPCRKit（BD 公司），anti-CSF1 抗体（Abclonal 公司），anti-rabbit-IgG（Sigma公司），NC 模（上海时代生物科技有限公司），SDS-PAGE 凝胶预制胶试剂盒（碧云天生物技术有限公司），Tween-20（上海生工生物工程有限公司），质粒pSPAX2、pMD2G、shRNA、人肾上皮细胞系 293T细胞由温州医科大学附属第一医院内科实验室保存。超净细胞工作台和细胞培养箱（Thermo
11、），低温高速离心机（Hettich），移液器（Eppendorf），流式细胞分析仪（FACS Calibur），数字化成像设备（GE Health-care），荧光倒置显微镜（Nikon），BIO-RAD凝胶电泳系统（伯乐公司）。细胞株实验组：子宫内膜癌Ishikawa 细胞（腺癌）；对照组：正常内膜细胞系ECT1/E6E7细胞，宫颈癌细胞株Hela细胞株（腺癌），乳腺癌细胞株 MCF7、胃癌细胞株 SGC-7901、结肠癌细胞系 SW620。上述所有细胞株由温州医科大学附属第一医院中心实验室赠送。本研究经温州市中西医结合医院医学伦理委员会审批通过。1.2方法1.2.1CSF1 mRNA 水平
12、表达检测采用实时荧光定量聚合酶链式反应法（real-time PCR）检测 CSF1基因表达情况。1106Ishikawa 细胞和 1mlTrizol 混合，按 Trizol 说明书抽提细胞 RNA。CSF1 引物跨内含子，所有引物序列由上海生工生物工程公司合成。引物：CSF1（108 bp）：上游 5-TGGCGAGCAGGA-GTATCAC-3，下游 5-AGGTCTCCATCTGACTG-TCAAT-3；ACTIN（101 bp）：上 游 5-AGAG-CTACGAGCTGCCTGAC-3；下游5-AGCACTGTG-TTGGCGTACAG-3；BCL-2（108 bp）：上 游 5-G
13、GTGGGGTCATGTGTGTGG-3，下游 5-CGGTT-CAGGTACTCAGTCATCC-3；BCL-X（108 bp）：上游5-GAGCTGGTGGTTGACTTTCTC-3，下游 5-TCCATCTCCGATTCAGTCCCT3；BAD（108 bp）：上游 5-CCCAGAGTTTGAGCCGAGTG-3，下游 5-CCCATCCCTTCGTCGTCCT-3；BAK（108 bp）：上游5-AGCAATGATCTGTTCACAACCG-3，下 游5-CGCCATGTATAGCCCAGGC-3；BAX（108 bp）：上游5-CCCGAGAGGTCTTTTTCCGAG-3，下 游
14、5-CCAGCCCATGATGGTTCTGAT-3。反应在10 l的体系中进行，其中2实时荧光定量PCR混合液5 l、10mol/L的上下游引物各0.2 l、样本cDNA1 l（50ng）、高压处理过的去离子水3.8 l。热循环如下：955min；9530s，6030s，7240s，32个循环；725min。应用 2Ct法分析 mRNA 相对表达水平。1.2.2CSF1 蛋白表达检测采用免疫印迹法检测CSF1 蛋白在子宫内膜癌细胞中的表达情况。采用含有蛋白酶抑制剂RIPA蛋白裂解液，按照说明书提取细胞内总蛋白量。采用 BIO-RAD 凝胶电泳系统，置于足量的电泳液中，根据测得的蛋白浓度上样，1
15、0%SDS-PAGE 胶电泳，恒压 80 V，90 min；电泳结束，将样品转移至NC膜，恒流 220mA，持续 90min。用 PBS 配置 5%脱脂牛奶，室温封闭 1h，然后用 PBS配置 2%牛血清白蛋白按相应浓度稀释抗体，4 轻摇孵育过夜。第2天，回收一抗，用含有0.1%Tween-20的 TBST 洗 NC 膜 5 min，洗 3 次；使用 PBS 配制 2%BSA，稀释二抗，NC膜室温孵育二抗 1h，然后用含有0.1%Tween-20 的 TBST 洗 NC 膜 5 min，共 3 次。凝胶图像采集及分析：采用 CCD 摄像头，Quantity One凝胶图像处理系统，分析得出蛋白
16、表达水平。1.2.3慢病毒shCSF1 制备1.5106293T细胞接种到 10 cm 细胞培养皿中，加入 10 ml DMEM 培养液（含 10%FBS）中；24h后，将质粒pSPAX2、pMD2G和目的基因敲除 shRNA 质粒（敲除组）或对照组质粒，按照 314 比例分别加入 1.5ml无菌EP管中，再加入 2.5mmol/L 氯化钙50 l，并用灭菌水补至 500 l，吹打混匀；将配置好的混合液逐滴加入 500l 2HBS，放置于室温静置 30min。将上述混合液缓慢、逐滴加入至 293T 细胞培养液中，4h 后，换液，用 10ml 新鲜DMEM 培养液（含 10%FBS）更换原培养液；48 h 后，收取该 293T 培养液上清液即慢病毒上清液。1.2.4构建 CSF1 敲除的子宫内膜腺癌细胞系将Modern Practical Medicine,May 2023,Vol.35,No.5 588 1105/ml 子宫内膜腺癌 Ishikawa 细胞，接种至 6 孔板，24h后弃去孔内原先培养基，将对照组及shCSF1慢病毒上清液加入孔内，37 2 000 r/min 离心感染2
